染色体嵌合体在基因检测中的研究进展

段福慧 综述 杨锡彤，罗雪颜，李思颖，王光明 审校

大理大学第一附属医院基因检测中心，云南 大理 671000

染色体异常是新生儿先天性疾病产生的主要原因，会出现多种畸形、身心发育障碍等严重的临床症状。新生儿先天生长发育异常和遗传性疾病为家庭和社会增加了许多负担，但目前尚无针对此类疾病的特异性治疗方法，所以及时的产前诊断和干预对于减少严重的先天性出生缺陷非常重要。染色体嵌合体(chromosomal mosaicism，CM)是指在同一个体中由于不同时期细胞分裂发生错误，可能导致机体同时存在两种或两种以上的细胞系，这些细胞系来源于单个受精卵[1]。许多研究表明CM 的染色体异质性与多种人类疾病有关，会影响健康和疾病中的基因组/染色体不稳定性和细胞间多样性[2]。目前，在产前筛查过程中CM的存在会影响孕产妇的妊娠结局是产前诊断的一大难题，由于CM 标本来源困难、检测技术局限，检出嵌合体更是面临着巨大的挑战。近年来，随着基因检测技术的发展，CM的检出率也随之提高，越来越多的CM 病例被报道。本文就CM 的形成机制、致病性及基因检测技术在产前诊断中的最新研究现状进行阐述，旨在为临床妊娠结局和产前遗传咨询提供参考。

1 嵌合体形成的机制

嵌合体形成的机制主要有以下几种：(1)染色体不分离:有丝分裂期间两条姐妹染色单体未能分离，两条染色单体被拉到一个细胞上，产生一个具有单体细胞系和另一个具有三体细胞系的嵌合体。(2)后期滞后:当染色单体未能黏附到纺锤体上或染色单体黏附到纺锤体上后未能与细胞核结合时，就会发生后期滞后。会导致该染色体在一个细胞中为单倍体，在另一个细胞中为正常的二倍体。(3)内复制：又叫多倍体是指染色体在没有分裂的情况下进行的复制。导致一个细胞中为在三体细胞系的嵌合，另一个细胞中为二体细胞系。染色体不分离、后期滞后和内复制导致非整倍性，有些有丝分裂事件会导致嵌合体，但仍存在二组细胞系。代替染色体以增益或损失方式呈现，可能会导致单亲二倍体(uniparental disomy，UPD)的产生。UPD是指两条染色体都来自于父亲或者母亲，其数目正常但表型异常的染色体[3]。UPD通过印迹基因或者隐性遗传病基因致病，UPD最常见的染色体是15号染色体，其中两个父系拷贝被称为安格曼综合征(Angelman)综合征，两个母系拷贝被称为普拉德-威利(Prader-Willi syndrome)综合征。不同机制来源的嵌合体可导致胎儿临床表型不同和子代再发风险不同，明确嵌合体形成机制可为产前遗传咨询提供理论依据。

2 染色体嵌合体的致病性

在受精卵发育成胚胎过程中，CM 可出现在胎盘组织、胎儿组织，或二者同时存在[1]。当染色体非整倍体仅出现在胎盘组织，而胎儿染色体为正常二倍体，即为限制性胎盘嵌合(confined placental mosaicism，CPM)时，胎儿容易发生宫内生长受限、早产，甚至胎死宫内，而母体可发生子痫前期等妊娠并发症。而嵌合体扩展到胎儿被称为真正的胎儿嵌合体，比CPM更罕见[4]。CM 为流产、先天性异常、发育迟缓和癌症的原因，Conlin 等[5]研究发现，在发育异常儿童中22%的儿童存在致病性拷贝数变异，CM 的比例为3.74%，其他研究结果也显示在先天性发育异常的儿童中CM的比例占0.5%～2.0%[6]。

染色体非整倍体是导致先天性疾病的重要原因，研究表明至少10%的人类妊娠可能受到非整倍体的影响[7]。非整倍体嵌合的形成机制复杂，在减数分裂/有丝分裂过程中均可发生，非整倍体的减数分裂错误是妊娠早期流产的主要原因。减数分裂或有丝分裂染色体错误分离的结果是UPD，影响UPD表型的方法主要为干扰印记染色体区域和将隐性等位基因减少为纯合子。UPD最突出的临床结局是印记障碍，印记障碍是由印记基因的平衡等位基因和父母起源特异性表达的改变引起的。尽管超过100 个人类基因受基因组印记调控，但它们倾向于聚集，因此只有一些染色体和染色体区域的UPD 与印记障碍表型有关。临床上，印记障碍是异质性的，它们影响生长、代谢和神经运动的发育。在产前，生长障碍、腹壁缺损和羊水过多可能提示印记紊乱，目前已报道过与UPD相关的基因组印记障碍疾病包括Silver-Russell 综合征、Temple 综合征、Kagami-Ogata 综合征、MulchandaniBhoj-Conlin综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、Kagami综合征、Prader-Willi综合征、Angelman综合征、假性低甲状旁腺素血症、新生儿短暂性糖尿病等[8]。其次，部分有丝分裂不分离引起的嵌合体，早期胚胎发育正常到发育后期形成的三体嵌合可能影响到一部分组织器官其危害较小[9]。非整倍体染色体嵌合的程度与疾病的严重程度呈正相关，较低水平的嵌合导致较温和的表型，高水平的嵌合会产生严重的表型并且嵌合体患者各组织器官的嵌合比例有可能不同，并随着年龄增长发生改变[10]。

性染色体嵌合体中异常核型患儿的临床症状千差万别，可能会造成胎儿性器官发育不全，或造成其他脏器结构和功能异常，有时会导致智力低下、精神障碍等临床表现[11-12]。其中特纳综合征可能是由隐匿性或组织特异性嵌合单体引起的与多种X 染色体失衡相关，最终导致关键X染色体区域丢失。由于个体染色体之间的差异，嵌合体的临床后果难以精确定位和解释。所以，当检测发现嵌合体现象时需结合各种产前筛查与诊断技术对嵌合体进行综合分析，并对胎儿形态进行细致的超声评估后才能做出下一步诊断。

3 染色体嵌合体常用的检测技术

目前临床上常用的检测技术有染色体核型分析、无创DNA 产前检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)、荧光原位杂交(fluorescencein situhybridization，FISH)、染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)和二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)等。传统的产前诊断取材方式有绒毛膜取样和羊膜腔穿刺术，在妊娠早期通常采集孕妇的绒毛组织，进行染色体核型分析。羊水染色体核型分析作为传统的产前诊断“金标准”能够直观地在显微镜下识别染色体的数目及结构异常，并且是检测染色体非整倍体最直观最有效的手段[13]。脐血染色体核型分析可对绒毛及羊水培养中出现的假性嵌合体进行验证，也能在绒毛及羊水培养失败时进行补救诊断。染色体核型分析对染色体分辨率低，仅能检出5～10 Mb以上的基因片段缺失或重复，小于5 Mb的微缺失/微重复不易检出，对于低比例嵌合的染色体无法检出[14]。染色体核型分析标本易污染、操作繁琐、对实验人员的技术和实验条件要求较高，临床上难以大批量检测，最终限制了该技术的发展。

NIPT 利用大规模平行测序技术(MPS)对母体外周血中的胎儿游离DNA(cffDNA)进行深度测序来获取胎儿的染色体信息，主要用于筛查胎儿染色体非整倍体。NIPT 具有无创性、高敏感性、高特异性和高通量等特点，在产前检测领域具有一定优势。Robins[15]报道NIPT 不仅可以筛查性染色体的数目异常，还可以筛查性染色体的嵌合体和CNV(基因拷贝数变异)，并在提示染色体结构异常中发挥重要作用。事实上，CMP、母体拷贝数变异、双胞胎消失、母体癌症和真正的胎儿嵌合体等因素会影响NIPT的结果。鉴于NIPT的筛查性质，所有阳性NIPT 结果都应进行侵入性检查以明确诊断。

FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术，目前这项技术已经广泛应用于染色体精细结构变异分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。其基本原理是用荧光标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检染色体、细胞或组织中的核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。通过荧光系统检测，对待测DNA进行定性或相对定位分析[16]。FISH 相对于传统的染色体核型分析而言无需进行细胞培养，具有检测快速、检测信号强、特异性高、重复性好等优点，能更直观地显示染色体的结构改变并能对一些染色体核型分析无法确定的嵌合类型做出辅助诊断，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。FISH 分析的细胞数目比染色体核型分析多10 倍，更易检出低比例嵌合的染色体，是一种前景很好的快速产前诊断技术。

染色体微阵列分析(CMA)通过阵列比较基因组杂交(a-CGH)或使用单核苷酸多态性(SNP)阵列进行分析。在产前诊断中，CMA 主要用于检测染色体失衡，可以准确检测染色体失衡的数量和结构异常，并可检测到微缺失和微重复等染色体改变[16]。与传统的细胞遗传学和FISH 技术相比，使用CMA 进行染色体异常产前遗传学诊断的最大优势在于CMA能够检测到更小的失衡，能够精确定义不平衡区域。这意味着可以准确地划定所涉及区域的边界(断点)，并且可以进一步评估该区域的基因序列，具有分辨率高、检测周期短、结果更客观的优点。其中a-CGH 技术可以分析基因组拷贝数变异，在检测嵌合体方面较传统的细胞学方法更敏感。而SNP 技术可以同时分析单核苷酸多态性和拷贝数变异，除了能够检测染色体CNVs外，还能够检出大多数单亲二倍体和三倍体，并可检出一定水平的嵌合体。许多研究表明，CMA可作为胎儿超声异常病例的主要产前诊断测试，可将正常核型胎儿的遗传异常检出率提高6%～7%[17]。已有研究报道对于产前超声异常而染色体核型分析正常时，CMA技术可作为首选检测方法[18]。

随着人类基因组图谱的完成，NGS 技术的出现彻底改变了DNA 测序。NGS 技术产生数百万或数十亿个短的、高可信度的基因组读数，测序读数通常为100～150 bp，可以是单读或双端测序。NGS 技术的高通量特性允许对测序片段进行非常高的倍数覆盖，并检测野生型等位基因中低水平的突变变体[19]。NGS技术具有高通量、高分辨率、检测费用逐年降低的优势，已经被运用到嵌合体检测方面，和a-CGH 技术相比NGS 技术在嵌合体检测方面更胜一筹[20]。除了NGS 技术其他方法也用于嵌合体鉴定，包括Sanger测序、高分辨率熔解(HRM)分析、等位基因特异性PCR、焦磷酸测序、SNaPshot 和免疫组织化学等，在NGS 时代这些技术在初步筛选和结果验证方面也发挥着重要作用。

4 结语

染色体嵌合体是产前诊断中一个普遍且复杂的现象，嵌合体的类型及临床后果受发育过程中产生嵌合体的地点、时间等多种因素影响。由于个体染色体之间存在差异导致嵌合体的临床后果很难确定和解释，使产前诊断和遗传咨询变得更加困难。近年来基因检测技术迅猛发展，为CM 的产前诊断带来了技术保证，合理利用各种检测技术可以提高产前筛查中CM 的检出率和准确率，为临床治疗和产前遗传咨询提供更可靠的诊疗依据、减少不必要的流产、预防新生儿出生缺陷。