Notch 信号通路在糖尿病肾病中的作用及中医药研究概况∗

张梦婷，张 颖，张 兰△，宫成军

1 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032； 2 辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

糖尿病具有高发病率，糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）为微血管病变，常见于病程长的糖尿病患者中［1］，其特征在于大量白蛋白尿的漏出，肾脏形态学改变，因为高血糖破坏了肾脏的血管，导致其功能障碍［2］。目前对DKD进展机制成因的理解大多为代谢失常、血流动力学改变、肾素-血管紧张素系统激活和氧化应激失衡等。Notch 信号通路在健康人群肾脏中处于抑制状态，而在机体代谢失衡进而出现损伤等情况刺激下该信号通路被激活，如高糖等导致肾小管上皮细胞纤维化、足细胞损伤等一系列病理变化［3］。近年来，大量研究表明，DKD 的发生发展与Notch 信号通路密切相关，传统中医药在DKD 防治方面表现出独特的优势。现就中医药通过干预Notch 信号通路治疗DKD进行综述。

1 Notch信号通路

Notch 信号通路级联反应高度保守，由Notch受体、配体、下游信号分子等组成［4］。Notch 受体在内质网中合成，并在高尔基体中加工，成熟的Notch 受体由一个Notch 胞外结构域和一个胞内部分（notch intra cellular domain，NICD）组成［5］。在哺乳动物中现已发现4 种Notch 受体，目前已知对DKD有明显调控作用的为Notch1。Notch配体有5 种，其中锯齿状成员配体（Jagged1）在DKD 的表达中有重要作用。Notch 受体与配体的作用方式为配体与胞外部分结合后诱导产生膜内调节蛋白，蛋白水解后释放Notch胞内NICD，转移到细胞核，组装成转录激活复合物［6］，经3 次酶切作用后，Notch的NICD随后进入细胞核，与中枢转录因子RBP-J 结合并激活转录，其中参与的下游信号分子有细胞内效应分子，三者结合后调控下游靶基因发状分裂相关增强子（hairy and enhancer of split，Hes1）、细胞内效应器（Hey）的表达，全程无第二信使参与，但它以组织特异性的方式调节了100多个靶基因的表达［7］。

2 Notch信号通路对DKD的影响

2.1 对足细胞的影响持续高糖刺激下被激活的Notch 信号通路可增加足细胞凋亡［8-9］，进而导致肾小球滤过膜通透性增高，血浆中大量蛋白滤过［10］。具体影响的分子机制为可表现为足细胞组蛋白表达及细胞自噬的改变。在组蛋白表达方面，主要影响Notch1 和Jagged1。研究发现，足细胞中转移抑制性组蛋白H3K27me3 富集在足细胞中Notch 配体Jagged1 的启动子区域，通过敲除Jag1 可导致足细胞去分化［11］，而组蛋白Sirt6 主要通过使组蛋白H3K9 脱乙酰化来抑制Notch1 转录保护足细胞免受损伤［12］。

在足细胞自噬方面主要集中于Notch1 上，以往在自噬中研究较多的是PI3K/AKT、mTOR、AMPK、ROS 等通路［13］。最新研究表明，激活足细胞自噬可能是预防DKD 进展的潜在疗法，自噬途径可抑制Notch 信号通路从而延缓足细胞损伤进程，一项糖尿病小鼠研究发现，p66Shc（肾小管氧化损伤生物标记物）可调节活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和诱导细胞凋亡。而p66Shc 的激活可增强足细胞自噬，其激活途径为抑制Notch-PTEN-PI3K/Akt/mTOR 通路［14］。1 项关于胰岛移植后高糖条件下Notch1 对足细胞影响的体内外实验中，发现高度激活的Notch1 抑制了胰岛功能细胞对肾损伤和足细胞恢复的疗效，而通过抑制Notch1 途径可下调足细胞凋亡水平，并抑制血管内皮生长因子的表达，但自噬表达没有得到明显改善［10］。在中药治疗足细胞自噬方面的研究中，发现含有葛根素［15］、芒果苷［16］、人参皂苷［17］等成分的中药均可通过调节自噬相关通路达到改善DKD的目的。

2.2 对肾纤维化的影响主要集中于Notch1、snail1、Jagged1 和Hes1 上，目前已经证明Notch通路（及其转录因子snail1）为DKD介导肾脏上皮-间质转化（extracellular matrix secretion，EMT）和纤维化不可或缺的调节分子［18］，其中snail1在DKD 中起着促进肾小管上皮细胞转化和激活Notch 通路的中介作用。在1 项对DKD 患者肾小球内皮细胞实验中，发现si-Numb 转染后内吞衔接蛋白可以抑制Notch1和Hes1的高表达从而逆转由高糖触发的EMT过程［19］。在DKD模型KKAY小鼠中，通过TGF-β1/smad 诱导EMT 时，Jagged1 和Hes1 的表达明显上调［20］，而Notch2 和Notch4 受体也参与其中［21］。在线粒体中，Notch 可通过抑制线粒体转录因子A（transcription factor A，mitochondrial，Tfam），调节肾小管上皮去分化和增殖，而Tfam 的表达增加可以挽救TGF-β1/Jagged1/Notch2 诱导的代谢缺陷和下游纤维化变化。由此可见TGF-β1/smad途径可能为Notch信号通路的上游活化分子［22］。

2.3 抑制Notch 通路的治疗效应目前，DKD 的治疗多以控糖、控压、减少尿蛋白为主。研究证明，降糖药如格列喹酮［21］、降压药如缬沙坦［23］等均可通过抑制Notch通路而保护肾脏。

Notch 抑制剂的使用可延缓足细胞损伤进程、改善肾脏上皮细胞EMT以及纤维化，如γ-分泌酶 抑 制 剂DAPT［24］、锌 转 运 家 族 成 员SLC39A7（ZIP7）［25］。有实验将HMGA2 基因与DAPT 相对比，发现HMGA2 基因表达能抑制Notch 通路中Notch1、Hes1的表达，同时上调Bcl-2和下调Bax，效果优于单用DAPT。以上说明，Notch 抑制剂的使用能延缓肾脏损伤进程，证明抑制Notch 通路可为临床治疗DKD提供新的借鉴［26］。

在miRNA 方面，WEI 等［27］通过DKD 大鼠实验发现在高糖条件下miR-145-5p 可以通过抑制Notch通路的激活来减弱足细胞凋亡，主要通过对NICD及Hes1 和Hey1 的抑制而实现。miR-135a 可通过调节Notch、NICD、和Hes1 的表达延缓DKD 大鼠肾纤维化［28］。其他miRNA 还有如miR-124a［29］、miR-146a［30］、miR-34a［31］等，作用机制均为抑制Notch通路及其下游靶基因而发挥护肾作用。

3 防治DKD中医药与Notch信号通路的关系

3.1 中药单体丹参中二萜醌能抑制高糖干预的肾小管上皮细胞（human kidney 2，HK-2）分泌a-平滑肌肌动蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）等合成，同时增高E-钙黏蛋白（E-Cadherin，E-cad）表达；在丹参酮Ⅱa联合DAPT用药后，发现对大鼠肾组织Notch/Jagged 相关蛋白表达亦有抑制作用，且呈现出量效关系［32-33］。实验发现，小檗碱通过抑制DKD 模型轻度肥胖型2 型糖尿病小鼠Notch 通路下游的锌指转录抑制因子（snail）、Jagged1 和Hes1的表达，延缓糖尿病肾病进展［20］。雷公藤甲素具有极强的护肾抗炎效果，可以通过抑制高糖干预的肾小球系膜细胞中Notch1 受体，阻断下游靶基因NICD、Hes1 和Hey 的表达，同时PDK1/AKT/MTOR 相关通路亦有下降，而miR-137-3P 的表达却增高，作用靶点为减轻HRMCS 细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积聚［34］。近年来研究发现，其亦有干预足细胞自噬及凋亡的作用［35］。天花粉凝集素是天花粉的活性成分，在STZ诱导的糖尿病大鼠中发现其可阻断巨噬细胞向M1型的极化，有助于增加足细胞的增殖潜力，作用机理为抑制Notch1、NICD和Hes1的表达来增加M2巨噬细胞比例从而减轻肾脏结构和功能的恶化［36］。

3.2 中药提取物研究发现，百令胶囊水提物有护肾作用，在高糖刺激肾小球系膜细胞（HBZY-1）后细胞出现异常增殖，而加入百令水提液后可减轻高糖诱导的系膜细胞增殖，HBZY-1中Notch1、Jagged1、Hes1 和mRNA 表达出现显著下调，同时TGF-β和细胞外基质FN合成、mRNA和蛋白表达均显著降低［37］。

3.3 中药复方江丹等［38］发现，益气升清方可减轻DKD 大鼠24 h 尿微量白蛋白排泄，机制为抑制Notch通路中Notch1、Jagged1以及上游TGF-β1的高表达。局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulo sclerosis，FSGS）为足细胞损伤典型表现。尚懿纯等［39］在对左肾切除加阿霉素注射法诱发SD大鼠FSGS模型地研究中发现，肾苏Ⅱ方可能通过调控Notch-P53 通路抑制足细胞损伤及凋亡速度，缓解FSGS大鼠病情恶化。榛花消肾安胶囊可有效下调DKD 大鼠肾脏Notch1、Jagged1、NICD、Hes1的表达，使足细胞相关蛋白表达Synaptopodin上调、TRPC6 下调而保护足细胞，检测发现血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、24 h 尿蛋白定量均显著降低［40］。朴松兰等［41］亦发现，解毒通络保肾胶囊降低蛋白尿可能与对足细胞的保护有关，这种保护作用可能是通过对Notch1和NICD的抑制而实现。杨冠男等［42］对糖尿病KKAY 小鼠使用糖肾宁胶囊进行实验发现，小鼠肾脏组织中E-cad 蛋白含量升高，a-SMA 蛋白含量减低，同时Jaggeg1、Notch1、Hes1、snail1 表达显著下降，检测发现Scr、BUN 及24 h 尿蛋白定量均降低，肾脏间质纤维化得到改善。周雪梅等［43-44］研究发现，丹蛭降糖胶囊可以降低采取左肾切除联合链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱 导 的DKD 模 型 大 鼠 中Notch 通路和CD34、CD144 表达水平，参与血管内皮损伤的修复；在肾小管上皮细胞胞质中，Hes1的表达也得到了一定程度的抑制；检测发现24 h尿蛋白定量也得到一定程度改善。研究发现，由黄芪、田七、当归、大黄等组成的益肾活血方可上调miR-126/VEGF-Notch 水平，促进肾脏小血管修复［45］。刘利飞等［46］研究发现，化瘀通络类中药组能够抑制DKD 大鼠Notch 通路Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 表达，这可能是其减少尿蛋白排泄、减轻肾脏损伤的作用机制之一，同时检测发现血清BUN、Scr 及尿酸的水平也得到有效降低。中医药通过Notch通路作用方式见表1。

表1 中医药通过Notch通路作用方式

4 小结

根据上述中医药治疗DKD 的对比，我们发现中医药通过抑制Notch 通路治疗DKD 主要集中于Notch1、Jagged1、NICD及下游靶基因Hes1和Hey1上，上游信号分子可能与转化生长因子β/重组人蛋白（transforming growth factor-β，TGF-β/smad）有关。在蛋白表达调控上，可下调肾脏组织a-SMA、TRPC6，上调E-cad及足细胞相关表达蛋白等，减少ECM积聚、促进足细胞损伤修复和减轻肾脏纤维化，从而改善肾小球滤过膜的稳定性以及肾小管、间质硬化进程，延缓DKD 向终末期肾病的转变。

在目前的研究中，首先，中医药通过Notch 通路治疗DKD的研究大多处于基因、转录及影响蛋白表达上，且研究靶点主要集中于Notch1、Jagged1和下游表达，而国外对于DKD 除Notch1 外的其他Notch 通路中的足细胞自噬、组蛋白表达、高通量测序等相关研究也已纯熟，故我们今后可以开展更深层次的探索性研究，寻找中医药作用于Notch通路治疗DKD的更精确调控机制。再者，目前通过Notch 通路治疗DKD 的研究大多局限于一条通路上，与其他通路的调控联系研究较少，上游除TGF-β/smad 外是否还有其他通路参与调控如NF-KB、mTOR、ROS 等，他们之间是如何协同或拮抗作用以及于此形成的复杂网络关系，值得我们进一步挖掘，从而更好地从分子层面更立体的阐述中医药治疗DKD 的原理。最后，在信号通路的中医理论研究方面，信号通路属于中医理论的哪一类，如何用中医基础理论解释这种干预信号通路治疗疾病的现象，更好地使现代研究手段、分子生物学理论与中医经典理论相结合，更好地服务于临床，需要我们进一步的探索和研究。