铜藻中岩藻黄素的提取工艺优化与含量测定

邢紫风，弓泽华，盛滟，李源，杨丝月，凌俊红

浙江海洋大学食品与药学学院（舟山 316022）

铜藻（Sargassum horneri）属褐藻门墨角藻目马尾藻科马尾藻属的大型海藻，在我国主要分布于辽宁、浙江、福建及广东等地[1]。铜藻中主要有褐藻糖胶、褐藻多酚、岩藻黄素、膳食纤维、脂肪酸、多糖等成分[2-4]，在食品、饲料、医药等领域具有良好的应用前景[5-6]。

岩藻黄素是褐藻和微藻（硅藻）产生的一种类胡萝卜素类天然产物，占天然类胡萝卜素总产量的10%以上[7-9]。岩藻黄素含有独特的高度共轭不饱和系统[10-11]，赋予该化合物优良的抗氧化、抗肥胖、抗炎及抗癌活性[12-16]。鉴于动物自身无法合成像类胡萝卜素类化合物[17]，因此岩藻黄素作为高附加值海洋功能食品、食用色素及海洋药物先导化合物具有很高的经济价值和科学研究价值[15,18-20]。岩藻黄素的提取方法有溶剂浸提法[21]、超声辅助提取法[22]、酶提取法[23]、超临界流体萃取法[24]等，超声辅助提取法具有操作简单、高提取率等优点。因此为研究岩藻黄素在海藻中的生物量，以铜藻为研究对象，优化岩藻黄素的提取工艺，测定其在铜藻中的含量，以期对铜藻进一步开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV2600紫外可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；G-100S超声波清洗器（深圳市歌能清洗设备有限公司）；OHAUS EX125DZH分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；Vortex-Genie 2涡旋仪（美国Scientific Industries公司）。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮（均为分析纯）；所用水为二次蒸馏水；岩藻黄素对照品（纯度大于95%，山东洁晶集团有限公司）；铜藻[寻山集团有限公司（山东）]。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品储备液的制备

精密称取13.2 mg岩藻黄素对照品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到1.32 mg/mL溶液，精密吸取1 mL上述溶液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到0.132 mg/mL对照品储备溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备

称取1.0 g铜藻，置锥形瓶中，加40 mL甲醇，称重，于60 ℃超声提取2次（200 W和53 kHz），每次45 min，用甲醇补足质量，合并2次提取液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.2.3 测定波长的确定

精密吸取1 mL“1.2.1”项的对照品储备液置100 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到1.32 μg/mL溶液，使用紫外可见分光光度仪，在200～800 nm波长范围内对其进行光谱扫描，确定选用447 nm作为岩藻黄素测定的波长。

1.2.4 标准曲线的建立

精密吸取适量“1.2.1”项的对照品储备液，配制成8.80，6.60，3.30，1.65，0.83和0.55 μg/mL系列标准质量浓度溶液，以甲醇为参比，用紫外可见分光光度仪在447 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 铜藻中岩藻黄素的测定

称取1.0 g铜藻，按“1.2.2”项的方法制备3份供试品溶液，测定吸光度，根据标准曲线计算即得岩藻黄素含量。

1.2.6 单因素试验

1.2.6.1 提取溶剂考察

称取1.0 g铜藻样品，置锥形瓶中，按样品质量的10倍体积数（mL）分别加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，在室温下超声提取30 min，提取液稀释后测定吸光度，根据标准曲线计算岩藻黄素含量，比较不同溶剂对岩藻黄素含量的影响。

1.2.6.2 溶剂体积考察

称取1.0 g铜藻样品，置锥形瓶中，分别按样品质量的10，20，30，40和50倍体积数（mL）加入甲醇，在室温下超声提取30 min，提取液稀释后测定吸光度，根据标准曲线计算岩藻黄素含量，比较溶剂体积对岩藻黄素含量的影响。

1.2.6.3 提取时间考察

称取1.0 g铜藻样品，置锥形瓶中，按样品质量的10倍体积数（mL）加入甲醇，在室温下分别超声提取10，30，45和60 min，提取液稀释后测定吸光度，根据标准曲线计算岩藻黄素含量，比较提取时间对岩藻黄素含量的影响。

1.2.6.4 提取温度考察

称取1.0 g铜藻样品，置锥形瓶中，按样品质量的10倍体积数（mL）加入甲醇，分别在25，45，60和75 ℃条件下超声提取30 min，提取液稀释后测定吸光度，根据标准曲线计算岩藻黄素含量，比较提取温度对岩藻黄素含量的影响。

1.2.6.5 提取次数考察

称取1.0 g铜藻样品，置锥形瓶中，按样品质量的10倍体积数（mL）加入甲醇，在室温下分别超声提取1，2和3次，每次45 min，提取液稀释后测定吸光度，根据标准曲线计算岩藻黄素含量，比较提取次数对岩藻黄素含量的影响。

2 结果与分析

2.1 岩藻黄素含量测定方法学研究

2.1.1 标准曲线

以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，岩藻黄素在0.55～8.80 μg/mL范围内呈现良好线性关系，回归方程为A=0.109 9C-0.007 1，r=0.999 3。

2.1.2 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，重复测定6次，记录吸光度，岩藻黄素吸光度的SRSD为0.44%（表1），说明该方法精密度良好。

表1 精密度试验结果（n=6）

2.1.3 重复性试验

按“1.2.2”项的方法平行制备6份供试品溶液，测定吸光度，计算得出岩藻黄素含量的SRSD为3.1%（见表2）。

表2 重复性试验结果（n=6）

2.1.4 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12和24 h测定，记录吸光度。岩藻黄素吸光度的SRSD为3.0%（见表3）。结果表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。

表3 稳定性试验结果（n=8）

2.1.5 回收率试验

采用加样回收法。精密称取9份1.0 g已知含量的铜藻样品，分别精密加入适量高、中、低3种质量浓度的对照品溶液，按“1.2.2”项的操作，制成加样回收率供试液，在447 nm波长下测定吸光度，计算回收率。结果显示，平均回收率为98.7%，SRSD为1.9%（见表4）。

表4 铜藻中岩藻黄素的回收率试验（n=9）

2.2 铜藻中岩藻黄素的含量

以“1.2.5”项制备的供试品溶液中岩藻黄素含量按式（1）计算，结果分别为518.1，517.8和521.6 μg/g，岩藻黄素的平均含量为519.2 μg/g。

式中：C为样品溶液中岩藻黄素的质量浓度，μg/mL；V为样品溶液体积，mL；M为铜藻质量，g。

2.3 单因素试验

以岩藻黄素含量为指标，单因素试验结果如图1～图5所示。

图1 提取溶剂对岩藻黄素含量的影响

图2 提取溶剂体积对岩藻黄素含量的影响

图3 提取时间对岩藻黄素含量的影响

图4 提取温度对岩藻黄素含量的影响提取2次时，岩藻黄素含量最高。

图5 提取次数对岩藻黄素含量的影响

结果表明，岩藻黄素在甲醇溶剂中含量最高，在乙醇溶剂中次之。

提取溶剂用量从10倍增加到50倍，在40倍量时岩藻黄素含量最大，但增加到50倍有小幅下降。

岩藻黄素含量随着提取时间的延长总体趋势是先上升，至45 min时趋于稳定，但在60 min时出现小幅下降，这可能是由于岩藻黄素稳定性差，时间长使其被破坏。

岩藻黄素的含量随着提取温度的升高总体趋势是先上升，至60 ℃时最高，但在75 ℃时明显下降，这可能是由于岩藻黄素热稳定性差，高温会使其破坏。

3 讨论

3.1 最优的提取工艺

铜藻中岩藻黄素的含量十分丰富，是一种理想的岩藻黄素提取原料，而超声辅助法提取岩藻黄素的提取效率高、方便快捷。提取溶剂的考察，选取4种常用的溶剂，提取效果是甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯，可能由于甲醇的穿透能力强于其他3种溶剂，故甲醇提取效果最好。而溶剂用量、提取温度、提取时间和提取次数考察以单因素试验得出，最优条件为提取溶剂甲醇、固液比1∶40（g/mL）、提取温度60℃、提取次数2次，每次45 min。

3.2 试验中的注意事项

由于岩藻黄素遇光不稳定，极易分解，故在试验过程中要保持避光。

制备的供试品溶液中存在细小粉末杂质，干扰测定。因此在测定前使用0.22 μm微孔滤膜滤过供试品溶液。

3.3 分析方法的验证

建立紫外可见分光光度法测定铜藻中岩藻黄素含量的方法，并通过线性、精密度、重复性、稳定性、提取回收率等方法进行验证，试验结果显示，在0.55～8.80 μg/mL范围内，岩藻黄素质量浓度与吸光度呈现良好的线性关系（回归方程为A=109.95C-0.007 1，相关系数r=0.999 3），精密度SRSD为0.44%，重复性SRSD为3.1%，回收率为96.6%～102.2%，证明建立的紫外可见分光光度法适合于测定铜藻中岩藻黄素含量，最终测得铜藻中岩藻黄素的平均含量为519.2 μg/g。

4 结论

通过超声辅助法从铜藻中提取岩藻黄素，以提取含量为考察指标，在单因素试验基础上优化岩藻黄素的提取工艺，研究得出岩藻黄素最佳提取工艺：提取溶剂甲醇、固液比1∶40（g/mL）、提取温度60 ℃、提取次数2次，每次45 min。最优工艺条件下得到的铜藻中岩藻黄素的平均含量为519.2 μg/g。研究试验数据为铜藻的进一步开发应用提供理论依据和技术参考。