大肠菌群快速检测纸片的影响因素分析

何荣强

海南省食品药品检验所三亚分所（三亚 572000）

大肠菌群是需氧和兼性厌氧，在一定条件下能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，生化反应为触酶阳性、氧化酶阴性、硝酸盐还原试验阳性。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希菌（Escherichia）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter）、产气肠杆菌（Enterobacter）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella）等。大肠菌群作为衡量食品的一个重要卫生指标，其含量表明食品被粪便污染的程度和有无肠道致病菌污染的可能，具有广泛的卫生学意义。据国家食源性疾病监测网统计结果显示，2007—2017年，5.6%的国内微生物食源性疾病事件是由大肠菌群引起的[1]。

快速检测纸片是将选择性培养基和目标菌株的显色底物混合后依附于滤纸片上制成的检测纸片，菌体通过吸收滤纸片的培养基生长繁殖。因检测前处理简单，处理时间短，检测后无污染性物质，符合环保要求，具有方便、快捷、经济等优点，给检验工作带来很大便利。快速纸片可同时进行取样和接种工作，减少二者操作的时间差进而在一定范围内避免不必要的细菌增殖带来的污染，从而得到更加真实的检验结果。快速纸片在节省人力、物力上也提供技术保障，许多一线检测机构因场地所限，不便购买更多仪器设备来满足检测需求，而采用纸片法则很好地解决这个问题[2]。美国官方分析化学家协会（AOAC）官方方法990.12《食品中细菌总数的检测再水化干膜法》[3]和加拿大的MFHPB-33食品菌落总数3M法[4]都采用纸片法检测食品中菌落总数。但国内实践中，只有GB 14934—2016《食品安全国家标准 消毒餐（饮）具》附录B大肠菌群检验[5]及GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》4.2菌落总数测试片[6]，采用快速纸片法检验。尽管快速纸片法和国标传统方法检验结果在统计学中没有太大差别[7]，但是实践发现快速纸片法检验的结果有时也会出现结果模糊不清，不易判断，检验结果少于实际菌落数等情况[8]，故对此问题影响因素进行一些深入探讨。

1 产品研发工艺影响

国内尚无统一的大肠菌群检测纸片质量鉴定标准，生产企业无法进行统一有效的生产质控。此外，不同生产企业有着各自的产品技术研发路线，难免会对检验结果的准确性造成不同程度影响。

1.1 纸片配方的成分影响

有试验采用纸片配方的正交试验分析对测定大肠菌群影响较大的4个因素，分别是乳糖、胆盐、蛋白胨和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC），即提供细菌充足的碳源、氮源，同时合适浓度的胆盐和TTC，对保持大肠菌群的优势生长同时抑制其他细菌并在纸片上有很好的显现是非常必要的[9]。菊粉添加到大肠菌群检测纸片中可以明显提高饲料大肠菌群检测纸片的灵敏度和准确性，且阳性样本检出率明显提高[10]。快速测试纸片配方上的不断改进是影响检验结果的重要因素之一。

1.2 添加剂的影响

添加适量的增稠剂可以使纸片浸液体系具有优良的增稠性、稳定性和水溶性，如0.1%～0.2%质量体积比的卡拉胶或魔芋胶、0.1%～0.3%黄原胶等增稠剂的使用均可起到良好的效果[11]。添加乳化剂可使纸片各溶质处于良好的分散状态，会增加纸片测试的均匀度和显色效果[12]。

1.3 pH对纸片的影响

纸片浸液在pH 6.5～7.0时，灵敏度最高，若pH低于6.0，纸片整体颜色偏黄，难以辨明是否有黄晕。在大肠菌群脱氢酶作用下，纸片浸液中的TTC接受氢生成红色的三苯甲胺和菌落周围产生的大量黄晕相叠加易呈现橙色[13]，易出现假阳性或抑制菌落生长而出现假阴性；若高于pH 7.0，大肠菌落数量少时，发酵产酸不足，出现可能检不出的假阴性。

1.4 酸碱指示剂的影响

应从反应底物以及指示剂变色范围内的pH考虑选择合适的酸碱指示剂。如溴甲酚紫pH变色范围5.2～6.8，大肠菌群通过发酵乳糖产酸使纸片pH下降，可使其显示黄色，反之为紫色。由于指示剂浓度过高或过低均会影响纸片显色变化的效果，从而影响判断，故溴甲酚紫质量浓度要控制在一定合理范围内，既不会浓度偏高而抑制大肠菌群的生长，也不会因浓度过低，使纸片上菌落红点清晰，但菌落周围产生的黄晕不明显，而造成假阴性[14]。

1.5 纸片制作参数影响

滤纸品质、吸附能力、表面密度等均会对纸片结果的准确性产生影响，如：滤纸孔过大，纸片双面都有菌落生长而无法计数；滤纸保水性差，无法保持充分湿度，不利于菌体生长；滤纸表面密度不均，培养基浸液分布不均，采样后也无法很好的扩散，致菌体生长分布不均。此外，2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC）用量要求需严格保证既不能抑制菌体生长，又能使现象显著能够观察[15]。纸片制作灭菌温度过高，培养基浸液温度过低，烘干温度偏高等也可影响纸片的质量，如出现纸片颜色不一致、色斑等。

2 检测方式方法影响

2.1 不同类型检品影响

快速纸片法在检测餐具、糕点、水质与发酵法检测结果符合率可达95%以上，但冷冻饮品、卤菜等检测结果符合率较低[16]。不同类型的检品因其成分不同，pH不同，会对该方法有影响，即检品成分越复杂，干扰因素则越多，对检测结果的影响就越大。餐具、水质其成分对方法的干扰小，检测结果准确度就高；反之，冷冻饮品、卤菜在pH、色素、盐度方面差异较大，检测结果准确度就低。

2.2 采样操作和人员影响

有国标法的应严格按照其进行采样[如GB 14934—2016《食品安全国家标准 消毒餐（饮）具》]。现场采样人员的无菌操作、是否按纸片操作说明流程、操作粘贴时间的长短、是否夹取纸片出现破损、是否作空白对照、检验人员的高度主观分析判断能力及专业熟练度等都会直接影响检测结果。

2.3 接种方式和接种量影响

湿式纸片接种方式和接种量一般应严格按照其产品说明书或国家标准方法进行，尤其注意接种时纸片的黏贴或涂抹位置应具有代表性。

干式纸片（以FilmplateTM为例）按“5点法”滴加接种，有试验表明：接种量（稀释后）1.0±0.1 mL时，纸片上形成单个红色菌落并显示出典型特征；接种量≤0.7 mL时，纸片易干，色泽暗淡且反应不典型；接种量1.3 mL时，纸片全为淡紫色并有红晕状；接种量≥1.5 mL时，纸片全为淡紫且无红晕。纸片吸水量与反应结果密切相关，应以纸片被检液浸透而又无多余水分渗出为宜，一般每张（25 cm2）纸片可吸收约1 mL检液[17]。“5点法”滴加接种并控制接种量1 mL，可使菌落生长更清晰、更典型，从而增加大肠菌群计数的准确性和一致性。

2.4 纸片重叠数量和培养时间影响

采样或点样结束后，应控制纸片的重叠数量，一般重叠数量小于10张，纸片经培养均可形成典型的大肠菌落。若重叠数量过多，可能出现菌落融合、扩散，边界不清的现象，会影响到大肠菌群计数。在36±1 ℃条件下，培养16～18 h即可观察结果。在实际检测中，培养约14 h时，可对纸片进行一次观察，若已出现少量典型菌落可继续培养至16 h。若菌落数较多，培养时间过长同样也可能出现菌落融合，边界不清的现象，从而影响大肠菌群计数。

2.5 检验结果不典型影响

在纸片法观察结果时，必须考虑样品的各种因素。虽然生物酶作用特异性和培养液的选择性对纸片法较高的准确性提供保证，能够很好的观察典型的阳性或阴性反应，但无法观察是否产气是纸片法重要的缺陷，而产气是大肠菌群对乳糖发酵主要特征之一。美国3M公司的PetrifilmTM大肠菌群测试片含有VRB（Violet Red Bile）培养基、冷水可溶性凝胶以及氯化三苯四氮唑（TTC）作为菌落指示剂，三者增强了大肠菌群计数效果。测试片表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后，计数红点周围有气泡的菌落数为大肠菌群数，阳性菌落在测试片上为红色，同时耐热大肠菌群发酵产生的气体也可直接被观察到[18]。在结果判断上，大肠菌群检测纸片若保持紫色不变为阴性；纸片变黄并在黄色背景上有片状红晕或红色斑点为阳性，但对纸片为紫色，在紫色背景上呈现红色斑点则不太好判断[19]。有试验表明，在紫色背景上呈现红色斑点的纸片中，用发酵法确证有50%左右的阳性率。此时，若仅凭个人经验来判断阳性或阴性可能会出现错误，要考虑样品的pH和非发酵菌的存在，在判断疑似结果时，应做发酵法确证试验来确定非常有必要。此外，还要考虑检验采取的方法检验结果偏离是否在可接受的范围内，对这些方法进行一致性验证，评价检验的各项参数，从而确定方法有效性。

3 结语和展望

快速纸片法显色剂系统单一，不能对细菌有针对性区别计数，开发更稳定高效显色物质十分重要。基于新型荧光染料其荧光特性及在活细胞内的稳定性，通过固定染色温度，时间在20～30 min范围即可快速检测[20]，与传统方法比较具有一致性，且具有较高精密度和准确度[21]。将快速纸片结合荧光法检测的应用可对微生物进行高效检测，该方法比美国分析化学家协会（AOAC）规定方法更加节省时间，进一步简化试验准备，便于携带，更适用于危害分析及关键控制点（HACCP）的现场监管。由于酶解产物均以荧光显示，并将特定物质固定化，同时能够对食品中微生物含量开展定量分析，故有着更广泛的应用前景，但纸片荧光法操作时仍要注意避免外源荧光物质的非特异性干扰，并做阳性和阴性对照。

快速纸片法虽具有方便、快捷、经济等优点，但大肠菌群检验结果的准确性会受到各类因素的影响，遇到判断结果有可疑的情况，要全面分析，必要时要做确证试验来提高大肠菌群检测的准确性，提升食品安全检测有效性。各种类型的大肠菌群快速检测纸片要质量稳定可靠，就必须保证其检测的特异性、敏感性、抗干扰性、采样后稳定性[22]等指标有高标准的全面质量控制，能更好保证大肠菌群快检纸片结果的可靠性和准确性。