固态纳豆调味品的制备及其挥发性物质分析

孙娜 王林林 朱秀娟 何九军 王华

摘要：选取低温核桃粕和黄豆为主要原料，利用单因素试验和Box-Behnken试验优化固态纳豆调味品制备工艺，并利用顶空固相微萃取结合气质联用（HS-SPME-GC-MS）技术对固态纳豆调味品挥发性风味物质进行了分析。结果表明，以50 g纳豆为基料，最优制备工艺为辣椒粉添加量8.5%、食盐添加量3.1%、花椒粉添加量2.4%、茴香粉添加量0.2%、丁香粉添加量0.1%、八角粉添加量0.1%，优化后的固态纳豆调味品色泽红亮、椒麻鲜香、氨味低，综合评分高达90.2。固态纳豆调味品中共检出挥发性风味物质111种，相对含量较高的为烃类（33.73%）、杂环类化合物（32.54%）和醇类（8.21%）。

关键词：低温核桃粕；固态纳豆调味品；制备工艺；纳豆激酶；挥发性物质

中图分类号：TS214.9      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0143-07

Preparation of Solid-State Natto Condiment and Analysis of Its Volatile Substances

SUN Na， WANG Lin-lin， ZHU Xiu-juan， HE Jiu-jun， WANG Hua

（Technique College of Agriculture and Forestry， Longnan Teachers College， Longnan 742500， China）

Abstract： The low-temperature walnut meal and soybean are selected as the main raw materials， the preparation process of solid-state natto condiment is optimized by single factor test and Box-Behnken test， and the volatile flavor substances of solid-state natto condiment are analyzed by headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS）. The results show that using 50 g natto as the basic material， the optimum preparation process is chili powder 8.5%， salt 3.1%， Zanthoxylum bungeanum powder 2.4%， fennel powder 0.2%， clove powder 0.1%， star anise powder 0.1%.The optimized solid-state natto condiment has bright red color， spicy and delicious taste， low ammonia odour， and the comprehensive evaluation score reaches 90.2. A total of 111 volatile flavor substances are detected in solid-state natto condiment， among which， the relative content of hydrocarbons （33.73%）， heterocyclic compounds （32.54%） and alcohols （8.21%） is higher.

Key words： low-temperature walnut meal; solid-state natto condiment; preparation process; nattokinase; volatile

substances

收稿日期：2023-02-11

基金項目：甘肃省青年科技基金项目（21JR7RK914）；陇南市科技计划项目（2022-S·JH-17）；陇南师范高等专科学校校级教学改革项目（JXGG2021014）

作者简介：孙娜（1988－），女，甘肃庆阳人，讲师，硕士，研究方向：发酵食品加工与开发。

纳豆（natto）通常以黄豆为原料，经纳豆菌发酵而成，成熟的纳豆色泽金黄，气味独特，表面会形成一种白色透明的纳豆菌膜，搅拌后挑起会有长长的拉丝[1]。纳豆是一种微生态健康食品，不仅营养丰富，而且具有预防高血压、降低胆固醇、改善血液循环等功效[2]。1987年，Sumi等[3]首次从纳豆中提取到纳豆激酶，并对其进行系统研究，发现其属于丝氨酸蛋白酶，具有显著的溶栓活性。但纳豆的特殊风味很难被中国消费者接受，在一定程度上阻碍了纳豆在中国市场上的推广，故进行纳豆制品风味的改良是当前研究的热点之一。

胡桃（Juglans regia L.）是胡桃科、胡桃属植物，俗称核桃，是一种药食兼备的优良经济作物[4-6]。随着核桃油市场规模的不断扩大，除直接食用外，核桃多被加工成核桃油。低温核桃粕是液压冷榨工艺生产核桃油过程中产生的一种副产物，蛋白质含量高达43%[7-9]，可为固态纳豆调味品发酵提供优质的蛋白资源。由于核桃粕中残余的油脂较高，开发难度较大，多数被用作饲料或直接丢弃，造成了资源的极大浪费[10-11]。目前关于固态纳豆调味品制备工艺的研究还鲜有报道，因此本研究利用低温核桃粕发酵制备固态纳豆调味品，不仅可以改善传统纳豆固有的不良风味，而且可为核桃粕和黄豆提供新的利用途径，同时丰富了固态调味料的种类，以期提高中国消费者对纳豆的接受度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温核桃粕：由成县九源农林产品开发有限公司提供；枯草芽孢杆菌：由陇南师范高等专科学校农林技术学院实验室提供；尿激酶、凝血酶、纤维蛋白原等试剂：购自黑龙江迪龙制药有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

7890A-5975C气质联用仪（GC-MS） 美国安捷伦科技有限公司；UV1810S紫外可见分光光度计 陕西恒盛仪器设备有限公司；LS-35L立式压力蒸汽灭菌器 山东创美机械科技有限公司；LRHS-250-Ⅱ恒温恒湿培养箱、SW-系列超净工作台 上海跃进医疗器械有限公司；GZX-9070MBE电热鼓风干燥烘箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BCD-216WDPX海尔电冰箱 海尔智家股份有限公司；MJ-CF07X7-101全自动食品真空封口机 美的电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

原料预处理：选取适量无损伤、无虫害、颗粒饱满、色泽鲜亮的黄豆，加水至料液比为1∶1（体积和质量比）浸泡过夜；由于块状和片状的核桃粕不利于纳豆发酵，将核桃粕粉碎后，过100目筛，保证粉末细腻无杂块，颗粒均匀，装瓶备用。

蒸煮：取适量浸泡好的黄豆与粉碎好的核桃粕粉末，分别装至锥形瓶中，加棉塞，于121 ℃蒸煮30 min。

接种：当处理好的核桃粕和黄豆降至一定温度时，按黄豆和核桃粕粉末混合物料的1%，接入枯草芽孢杆菌菌液，使菌液充分与混合物料接触。

发酵：将接种好的混合物料取出转移至培养皿中，置于40 ℃恒温恒湿培养箱中发酵24 h。

后熟：将混合物料取出，置于4 ℃冰箱中后熟18 h。

搅拌：后熟结束后将混合物料取出，置于盆中，按比例加入辣椒粉、食盐、花椒粉等调味料，搅拌均匀。

捏胚：用手将混合物料捏成大小统一的球形胚子。

干燥：将球形胚子放置于40～50 ℃的电热鼓风干燥箱中，烘至水分含量达到30%为止。

真空包装、成品：用真空包装机封口保存。

1.3.3 固态纳豆调味品的单因素试验设计

在基础配方不变的条件下，以固态纳豆调味品综合评分为指标，选取对固态纳豆调味品综合评分影响显著的3个主要因素：辣椒粉添加量（6%、7%、8%、9%、10%）、食盐添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、花椒粉添加量（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%），进行单因素试验。

1.3.4 固态纳豆调味品的Box-Behnken试验设计

选取影响固态纳豆调味品综合评分的主要影响因素辣椒粉添加量（A）、食盐添加量（B）和花椒粉添加量（C）为试验因素，以综合评分为考察指标，设计Box-Behnken试验，试验因素和水平见表1。

1.4 综合评价指标

本试验以纳豆激酶活力和感官评分的加权分值为综合评价指标，纳豆激酶活力与感官评分各占50%[12]，在此基础上对固态纳豆调味品制作工艺进行优化。综合评分的具体计算公式如下：

综合评分=0.5×（纳豆激酶活力/纳豆激酶活力最大值×100+感官评分）。

1.4.1 感官评价

选择10名食品专业人员，从固态纳豆调味品的组织状态、气味、色泽及口感4个方面进行感官评分[13]，具体评价标准见表2。

1.4.2 纳豆激酶活力测定

参照付文静等[14]改良的分光光度法测定纳豆激酶活力。

1.5 挥发性物质测定

参照黄燕等[15]的方法，略作修改。

称取研碎均匀的固态纳豆调味品样品3.00 g，置于15 mL固相微萃取仪采样瓶中，加入1 g NaCl和6 mL超纯水，加入搅拌磁子，快速密封。将SPME萃取纤维头在GC-MS进样口于250 ℃老化至无杂峰，将样品瓶置于固相微萃取装置上，设定温度为50 ℃，转速为500 r/min，将样品预热15 min，于250 ℃解吸3 min，进行GC-MS分析。

色谱条件：色谱柱为HP-5MS（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；色谱柱起始温度为40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升至150 ℃，以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持5 min；气化室温度250 ℃；传输线温度280 ℃；载气He；载气流量1 mL/min；不分流。

质谱条件：EI源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；扫描模式为Scan；扫描质量范围为10～500 u。

2 结果分析

2.1 尿激酶标准曲线

配制5种不同浓度的标准尿激酶溶液（2 000，1 000，500，250，125 U/mL），在37 ℃下与纤维蛋白作用1 h后，于655 nm波长处测定其吸光度值，以尿激酶活力对数为横坐标，以ΔOD655 nm/h为纵坐标，绘制标准曲线[14]，其线性回归方程为y=0.010 7x－0.014 6，R2=0.996 1，见图1。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 辣椒粉添加量对纳豆激酶活力及品质的影响

由图2可知，固态纳豆调味品的综合评分和感官评分均呈先上升后下降的趋势，而纳豆激酶活力则呈下降趋势。这可能是因为辣椒粉添加量对固态纳豆调味品的组织状态、气味、色泽和口感影响较大。当辣椒粉添加量过多时，辣味偏重，固态纳豆调味品的固有风味被完全遮盖，导致感官评分下降；当辣椒粉添加量过少时，辣味不明显，不能与固态纳豆调味品的其他成分较好协调，导致固态纳豆调味品色泽暗淡，氨味明显[15]。此外，因固态纳豆调味品中纳豆基量不变，隨着辣椒粉添加量的不断增加，纳豆激酶活力会逐渐下降。综合考虑，辣椒粉添加量为8%时，综合评分最高。

2.2.2 食盐添加量对纳豆激酶活力及品质的影响

由图3可知，固态纳豆调味品综合评分和感官评分均呈先上升后下降的趋势，而纳豆激酶活力则呈下降趋势。这可能是因为当食盐添加量小于3%时，固态纳豆调味品的咸度不够，不能较好地与其他成分协调，导致固态纳豆调味品的滋味不足，感官评分下降；当食盐添加量大于3%时，固态纳豆调味品滋味太咸，影响口感。此外，一定浓度的食盐对微生物和酶活力都有较强的抑制作用[16]。综合考虑，食盐添加量为3%时，综合评分最高。

2.2.3 花椒粉添加量对纳豆激酶活力及品质的影响

由图4可知，固态纳豆调味品的综合评分和感官评分均呈先上升后下降的趋势，纳豆激酶活力呈下降趋势。这可能是因为花椒粉添加量在一定范围内，能够提升固态纳豆调味品的风味，但超过一定添加量，会带有些许苦味，反而使固态纳豆调味品的感官品质下降。综合考虑，花椒粉添加量为2.5%时，综合评分最高。

2.3 响应面试验结果

根据单因素试验结果，固态纳豆调味品制作工艺的Box-Behnken试验结果见表3，方差分析结果见表4。

以辣椒粉添加量（A）、食盐添加量（B）和花椒粉添加量（C）为自变量，以综合评分（Y）为因变量，得到二次多元回归方程：Y=94.54－4.85A－1.25B－1.60C+2.05AB－2.50AC-6.75BC－12.07A2－6.62B2－7.87C2。

由表4可知，模型达到极显著水平（P<0.01），而失拟项不显著（P＞0.05）。方程一次项（A、B、C）、二次项（A2、B2、C2）和交互项（AB、AC、BC）对综合评分的影响显著（P<0.05），其决定系数R2=0.991 1，与校正系数RAdj2=0.979 8相近，表明试验误差小，试验值与预测值有较好的拟合度，可用于固态纳豆调味品制作工艺优化的理论预测。

对辣椒粉添加量（A）、食盐添加量（B）和花椒粉添加量（C）两两交互作用进行分析，其响应曲面和等高线见图5。响应曲面越陡峭，说明影响越显著；曲面越平坦，说明影响越小[17]。

由图5可知，辣椒粉添加量（A）对综合评分的影响最大，花椒粉添加量（C）次之，食盐添加量（B）的影响最小。等高线图可直观反映两因素之间交互作用的显著程度。等高线呈椭圆形，说明交互作用显著；等高线呈圆形，说明交互作用不显著[18]。由等高线图可知，辣椒粉添加量和食盐添加量（AB）、辣椒粉添加量和花椒粉添加量（AC）、食盐添加量和花椒粉添加量（BC）等高线均呈椭圆形，交互作用显著，这与表4方差分析的结果一致。

通过Design Expert 10软件进行数据分析，各因素对固态纳豆调味品制备工艺的影响顺序为辣椒粉添加量>花椒粉添加量>食盐添加量。预测固态纳豆调味品制备工艺为辣椒粉添加量8.5%、食盐添加量3.1%、花椒粉添加量2.4%，在此优化条件下，固态纳豆调味品综合评分的理论值为89.2。通过3次验证试验，实际测得综合评分为90.2，与预测值接近，表明采用响应面分析优化得到的固态纳豆调味品制备工艺参数准确可靠，可用于实际操作。

2.4 固态纳豆调味品挥发性物质分析

由表5可知，固态纳豆调味品通过HS-SPME-GC-MS技术共检索鉴定出111种挥发性物质，其中烃类41种，占总含量的33.73%；醇类17种，占总含量的8.21%；醛类5种，占总含量的2.42%；酮类7种，占总含量的3.24%；酸类5种，占总含量的5.82%；酯类9种，占总含量的1.11%；杂环类化合物18种，占总含量的32.54%；酚类4种，占总含量的2.19%；其他化合物5种，占总含量的1.51%。在测得的挥发性风味物质中，烃类物质含量最高，这可能与加入的辣椒、花椒、茴香和丁香等香辛料有关。烃类物质中角鲨烯相对含量高达15.55%，这可能与选用的核桃粕、黄豆等原材料有关，核桃粕和黄豆中均含有丰富的角鲨烯成分，角鲨烯具有令人愉悦的特殊香气，具有提高体内超氧化物歧化酶活性、增强机体免疫力、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功效。杂环类化合物的含量次高，其中吡嗪类化合物含量最高，2，5-二甲基吡嗪和2，3，5-三甲基吡嗪的相对含量分别为27.51%和2.47%。吡嗪类化合物是纳豆香味物质的主要成分，具有使血液不易凝固的作用[19]。醇类物质含量也相对较高，固态纳豆调味品中检测到的大多数醇类都具有特征性的气味，这可能与添加的外源物质香辛料有关，亦或是糖类物质在耐盐酵母作用下生成的[19]。

3 结论

本试验采用低温核桃粕和黄豆为主要材料，辅以辣椒粉、食盐、花椒粉等调味料，以感官评分和纳豆激酶活力为综合评价指标，通过单因素试验和Box-Behnken试验改良了固态纳豆调味品的制作工艺及风味。结果表明，以50 g纳豆为基料，最优制作工艺为辣椒粉添加量8.5%、食盐添加量3.1%、花椒粉添加量2.4%、茴香粉添加量0.2%、丁香添加量0.1%、八角添加量0.1%。在此条件下，固态纳豆调味品综合评分高达90.2，固态纳豆调味品实际测得综合评分与模型预测值相近，可用于实际操作。所得产品色泽红亮，辣味鲜香悠长，椒麻香气中带有淡淡的核桃味，味道有麻与辣、鲜与香的层次感，口感、风味更符合中国消费者的需求。

通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对固态纳豆调味品挥发性风味物质进行分析鉴定，共检出挥发性风味物质111种，相对含量较高的为烃类物质（33.73%）、杂环类化合物（32.54%）和醇类物质（8.21%），这3类物质对固态纳豆调味品的香气具有重要贡献。选用核桃粕和黄豆混合发酵生产固态纳豆调味品，不仅可以使核桃粕得到高值化利用，而且可以改善傳统固态纳豆调味品固有的不良风味，加快纳豆食品在中国市场的推广，市场前景广阔。

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