两种发酵工艺豆类亚硝酸盐与硝酸盐代谢规律

唐双庆 屈雅宁 陈禅友 王亚珍 王红波

摘要：通过分别接种干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌发酵绿豆、红豆、豇豆、蚕豆、菜豆、大豆、豌豆和扁豆8种传统食用豆类，研究了连续发酵7 d的豆类中亚硝酸盐和硝酸盐代谢变化规律。结果表明，干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌均具有亚硝酸还原酶活性；干酪乳杆菌发酵豆类的亚硝酸盐含量均在第2天达到最高值，与枯草芽孢杆菌发酵豆类的亚硝酸盐含量最高值的出现时间不同；两种发酵工艺中豆类亚硝酸盐含量均低于国家标准中规定的最大残留量20 mg/kg。干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌是发酵制备不同豆制品的理想菌株，亚硝酸盐的食品安全性控制良好。该研究为发酵豆类食品中亚硝酸盐的食品安全性提供了重要的理论依据。

关键词：发酵；豆类；亚硝酸盐；硝酸盐

中图分类号：TS214.7      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0070-07

Metabolism Rule of Nitrite and Nitrate in Beans by

Two Fermentation Processes

TANG Shuang-qing1， QU Ya-ning1， CHEN Chan-you2， WANG Ya-zhen3， WANG Hong-bo1，2，3*

（1.Research Center of Food Nutrition and Safety， School of Life Sciences， Jianghan University，

Wuhan 430056， China; 2.Hubei Province Engineering Research Center for Legume Plant，

Wuhan 430056， China; 3.Hubei Enterprise-School Joint Innovation Center of

Healthy Sugar Substitute Product， Wuhan 430056， China）

Abstract： The metabolic rule of nitrite and nitrate in beans fermented continuously for seven days are studied by inoculating Lactobacillus casei and Bacillus subtilis to ferment eight kinds of traditional edible beans， including mung bean， red bean， cowpea， broad bean， kidney bean， soybean， pea and lentil. The results show that both Lactobacillus casei and Bacillus subtilis have nitrite reductase activity. The nitrite content in beans fermented by Lactobacillus casei all reaches the highest value on the second day， and the highest nitrite content in beans fermented by Bacillus subtilis appeares at different time. The nitrite content in beans by two fermentation processes is both lower than the maximum residue amount of 20 mg/kg in the national standard. Lactobacillus casei and Bacillus subtilis are ideal strains for fermenting different bean products， and the food safety of nitrite is well controlled. This study has provided an important theoretical basis for the food safety of nitrite in fermented bean foods.

Key words： fermentation; beans; nitrite; nitrate

收稿日期：2023-02-05

基金項目：武汉市属高校产学研项目（CXY202202）；湖北省技术创新专项（重大项目）（2017ABA147）；江汉大学一流学科建设重大专项资助计划（2023XKZ023）

作者简介：唐双庆（1997—），女，硕士，研究方向：食品微生物。

通信作者：王红波（1982—），男，副教授，博士，研究方向：食品加工与安全。

豆类营养物质丰富，是具有抗氧化、降血压和降血糖等多种功能的生物活性物质[1—2]。豆类是我国重要的食品加工原料，既能制成豆腐和豆芽等非发酵豆制品，也能制成豆腐乳、豆乳饮料和纳豆等发酵豆制品[3]。常见的发酵豆制品微生物菌株有芽孢杆菌、乳酸菌和红曲霉等。其中芽孢杆菌和乳酸菌等益生菌能够改善豆类的营养品质和生物学功能，还能赋予豆类食品独特的风味，使发酵豆制品深受市场喜爱，豆制品在市场中占有重要地位[4—5]。豆制品的发酵方法包括接种发酵、自然发酵和混合发酵等。在自然发酵过程中由于条件难以控制，产品安全质量难以保障，因此人工接种发酵被认为是较理想的发酵方法[6]。发酵食品中亚硝酸盐的含量一直是公众关注的焦点。由于豆类与根瘤菌形成共生固氮体系，将大气中游离态氮转化为自身可利用的氨态氮源硝酸盐，导致豆类能够累积较多硝酸盐[7]。硝酸盐是亚硝酸盐的前体，硝酸盐在硝酸还原酶作用下可还原为亚硝酸盐。过量亚硝酸盐可导致红细胞中亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去携氧能力，在一定条件下，可在人体中发生反应生成强致癌物质亚硝胺[8—9]。目前，发酵食品中亚硝酸盐含量的研究主要集中在以白菜、生姜、辣椒和豇豆为原料的泡菜中，对发酵豆制品亚硝酸盐代谢变化规律研究较少。因此，本研究以绿豆、红豆、豇豆、蚕豆、菜豆、大豆、豌豆和扁豆作为研究对象，分别探究了在干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌两种发酵工艺条件下8种不同豆子中硝酸盐和亚硝酸盐含量变化规律。本研究为利用不同豆子生产豆乳和纳豆等发酵豆制品的亚硝酸盐安全性提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

绿豆、红豆、豇豆、蚕豆、菜豆、大豆、豌豆和扁豆：由湖北省食用豆類植物自然科技资源中心提供；枯草芽孢杆菌ATCC 6051和干酪乳杆菌NRRL B-441：保藏于湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心。

1.2 试剂

硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水对氨基苯磺酸、N-（1-萘基）乙二胺盐酸盐（N-（1-Naphthyl）ethylenediamine dihydrochloride）、水杨酸、浓硫酸、硝酸钾（均为分析纯）和LB液体培养基：国药集团化学试剂有限公司；MRS液体培养基：北京酷来搏科技有限公司；亚硝酸还原酶（NiR）试剂盒：泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SMF01磨粉机 苏泊尔电器公司；AE224C电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；FreeZone 6 Plus冷冻干燥机 美国Labconco公司；HWS-24电热恒温水浴锅 上海尚道仪器制造有限公司；650N超声波细胞破碎仪 宁波新艺超声设备有限公司；Multiskan Go 1510全波长酶标仪 赛默飞世尔科技公司。

1.4 方法

1.4.1 菌种纯化及发酵处理

将枯草芽孢杆菌和干酪乳杆菌分别划线接种至LB固体培养基和MRS固体培养基中（在LB液体培养基和MRS液体培养基的基础上加入琼脂获得），挑选单菌落接种至 LB液体培养基和MRS液体培养基中培养24 h作为发酵液。将8种豆类磨成细碎粉末，以锥形瓶作为发酵容器，称取适量豆粉置于其中，于121 ℃下灭菌15 min。以5%的接种量将菌液分别接种至8种豆粉中，未接种样品设为对照组，发酵时间设为7 d，每天随机取样[10—11]。

1.4.2 亚硝酸盐含量测定

按照GB 5009.33—2016测定8种发酵豆类亚硝酸盐含量[12]。制得亚硝酸钠标准曲线为y=0.018 4x+0.002 8，R2=0.999 4。

1.4.3 硝酸盐含量测定

称取2 g发酵和未发酵样品，加入10 mL蒸馏水置于沸水浴中30 min，冷却后过滤，冲洗残渣，收集滤液定容至25 mL，备用待测。制备500 μg/mL硝酸钾标准溶液，分别吸取1，2，4，6，8，10，12 mL硝酸钾标准溶液，定容至50 mL容量瓶中，得系列标准溶液。吸取上述系列标准溶液或样品溶液0.1 mL，分别加入0.4 mL 50％水杨酸-硫酸溶液，摇匀，室温下放置20 min后，加入8％氢氧化钠溶液9.5 mL，摇匀冷却至室温，以蒸馏水作为空白对照，于410 nm处测定吸光度值[13]。

1.4.4 干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌生长曲线测定

将干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种至MRS液体培养基和LB液体培养基中活化12～16 h，以2％的接种量接种至培养液中，每隔2 h取样于600 nm吸光度处测定OD值，制作生长曲线。

1.4.5 干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌亚硝酸还原酶活性测定

按照亚硝酸还原酶（NiR）试剂盒说明书测定。酶活定义：每104个细菌每1 h还原1 μmol NO2-的量为一个酶活力单位。

1.4.6 数据分析

实验均重复3次，结果均用“平均值±标准差”表示。运用Microsoft Excel 2010整理数据，运用OriginPro 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 两种发酵工艺条件下豆子中亚硝酸盐和硝酸盐含量变化

2.1.1 干酪乳杆菌发酵豆子中亚硝酸盐和硝酸盐含量变化

干酪乳杆菌发酵8种不同豆子亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1。

干酪乳杆菌发酵绿豆硝酸盐和亚硝酸盐含量变化规律见图1中a。未发酵绿豆中亚硝酸盐含量为（0.73±0.14） mg/kg，硝酸盐含量为（333.25±16.71） mg/kg。干酪乳杆菌发酵绿豆第2天亚硝酸盐含量最高，出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（2.48±0.27） mg/kg。发酵第3天亚硝酸盐含量下降，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.32±0.27） mg/kg。发酵绿豆硝酸盐含量前3 d持续上升至（584.94±35.59） mg/kg，第4天下降至（450.24±35.59） mg/kg，发酵第7天硝酸盐含量上升至603.39 mg/kg。

干酪乳杆菌发酵红豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1中b。未发酵红豆亚硝酸盐含量为（0.24±0.12） mg/kg，硝酸盐含量为（365.36±29.29） mg/kg。干酪乳杆菌发酵红豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（1.89±0.23） mg/kg，发酵第3天亚硝酸盐含量下降，发酵第7天亚硝酸盐含量为（0.95±0.23） mg/kg。发酵红豆前4 d硝酸盐含量无明显变化，发酵第5天硝酸盐含量下降至（293.40±58.32） mg/kg，发酵第7天硝酸盐含量达到（614.46±44.29） mg/kg。

干酪乳杆菌发酵豇豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1中c。未发酵豇豆亚硝酸盐含量为（0.73±0.14） mg/kg，硝酸盐含量为（588.63±40.80） mg/kg。干酪乳杆菌发酵豇豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（1.81±0.12） mg/kg，发酵第4天亚硝酸盐含量降至最低，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.17±0.01） mg/kg。发酵前4 d豇豆硝酸盐含量逐渐下降，发酵第5天硝酸盐含量增加至（582.17±63.98） mg/kg。

干酪乳杆菌发酵蚕豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1中d。未发酵蚕豆亚硝酸盐含量为（0.89±0.28） mg/kg，硝酸盐含量为（450.24±8.45） mg/kg。干酪乳杆菌发酵蚕豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（1.59±0.34） mg/kg。随后亚硝酸盐含量相对稳定，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.03±0.13） mg/kg。发酵蚕豆硝酸盐含量第2天最高，发酵第7天硝酸盐含量为（575.71±34.57） mg/kg。

干酪乳杆菌发酵菜豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1中e。未发酵菜豆亚硝酸盐含量为（1.32±0.24） mg/kg，硝酸盐含量为（673.57±51.41） mg/kg。干酪乳杆菌发酵菜豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（2.48±0.27） mg/kg，随后开始下降，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.42±0.01） mg/kg。发酵菜豆硝酸盐含量第1天最高，第6天最低，发酵第7天硝酸盐含量为（744.08±29.62） mg/kg。

干酪乳杆菌发酵大豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1中f。未发酵大豆亚硝酸盐含量为（0.87±0.14） mg/kg，硝酸盐含量为（802.68±41.80） mg/kg。干酪乳杆菌发酵大豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（1.82±0.34） mg/kg，随后亚硝酸盐含量变化平缓，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.34±0.48） mg/kg。发酵大豆硝酸盐含量变化趋势与发酵菜豆相似，发酵第7天硝酸盐含量为（799.45±50.51） mg/kg。

干酪乳杆菌发酵豌豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图1中g。未发酵豌豆亚硝酸盐含量为（0.96±0.14） mg/kg，硝酸盐含量为（1 374.70±3.19） mg/kg。干酪乳杆菌发酵豌豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（2.28±0.38） mg/kg，随后亚硝酸盐含量相对稳定，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.18±0.41） mg/kg。发酵大豆硝酸盐含量第6天最低，发酵第7天硝酸盐含量为（1 505.71±41.79） mg/kg。

图1中h为干酪乳杆菌发酵扁豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化。未发酵扁豆亚硝酸盐含量为（1.11±0.12） mg/kg，硝酸盐含量为（367.20±32.44） mg/kg。干酪乳杆菌发酵扁豆第2天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（1.81±0.12） mg/kg，随后亚硝酸盐含量变化平缓，发酵第7天亚硝酸盐含量为（1.10±0.12） mg/kg。发酵扁豆前3天硝酸盐含量逐渐上升，第4天迅速下降，发酵第7天硝酸盐含量为（383.81±25.57） mg/kg。

干酪乳杆菌发酵8种豆子亚硝酸鹽含量先升高后下降，均在发酵第2天出现亚硝峰，这与Huang等[14]、纪淑娟等[15]的结论相似。干酪乳杆菌发酵豆子3～4 d亚硝酸盐含量相对较低，食品安全性较高。发酵过程中亚硝酸盐含量下降是由于发酵过程中干酪乳杆菌代谢产生亚硝酸还原酶，将亚硝酸盐还原为一氧化氮，使亚硝酸盐含量降低[16]。发酵过程中豆子亚硝酸盐含量始终低于GB 2762—2017中规定的亚硝酸盐最大残留量20 mg/kg[17]。而发酵豆类硝酸盐含量在较高水平，硝酸盐不能还原生成亚硝酸盐，这是由于干酪乳杆菌有较低甚至没有硝酸还原酶活性，具有高活性的硝酸还原酶通常来源于有害微生物 [18—19]。干酪乳杆菌发酵不同豆子的亚硝酸盐含量始终能维持在20 mg/kg安全水平以下，是理想的豆制品发酵菌株。

2.1.2 枯草芽孢杆菌发酵豆子中亚硝酸盐和硝酸盐含量变化

枯草芽孢杆菌发酵绿豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中a。枯草芽孢杆菌发酵绿豆亚硝酸盐含量逐渐增加，第6天亚硝酸盐含量最高，出现亚硝峰，含量为（1.70±0.23） mg/kg，第7天下降至（1.03±0.23） mg/kg。发酵第1天绿豆硝酸盐含量迅速上升至（559.11±43.23） mg/kg，随后逐渐下降，发酵第6天硝酸盐含量为（308.15±13.93） mg/kg，第7天硝酸盐含量上升至（499.75±49.32） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵红豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见 图2中b。枯草芽孢杆菌发酵红豆第4天亚硝酸盐含量最高，出现亚硝峰，含量为（1.61±0.46） mg/kg，发酵第7天为（0.45±0.32） mg/kg。红豆发酵第4天硝酸盐含量最低，为（243.57±34.57） mg/kg，随后逐渐上升，发酵第7天硝酸盐含量为（600.32±74.32） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵豇豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中c。枯草芽孢杆菌发酵豇豆在第2天和第5天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量分别为（1.25±0.01） mg/kg和（1.70±0.23） mg/kg，发酵第7天为（2.02±0.17） mg/kg。豇豆发酵1天后硝酸盐含量下降，随后先上升再下降，变化显著，发酵第7天硝酸盐含量为（618.77±76.74） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵蚕豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中d。枯草芽孢杆菌发酵蚕豆在第2天和第5天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量分别为（1.33±0.34） mg/kg和（1.54±0.34） mg/kg，发酵第7天为（1.54±0.34） mg/kg。发酵蚕豆硝酸盐含量第3天最低，随后先上升再下降，发酵第7天硝酸盐含量为（468.69±66.96） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵菜豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中e。枯草芽孢杆菌发酵菜豆在第3天和第6天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量分别为（1.88±0.31） mg/kg和（1.47±0.23） mg/kg，发酵第7天为（0.66±0.12） mg/kg。菜豆发酵5天硝酸盐含量逐渐下降至（282.32±11.07） mg/kg，随后上升，发酵第7天硝酸盐含量为（450.24±75.57） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵大豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中f。枯草芽孢杆菌发酵大豆在第6天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（2.19±0.24） mg/kg，发酵第7天为（1.32±0.24） mg/kg。大豆发酵第4天硝酸盐含量达到最低值（674.74±52.24） mg/kg，随后上升，发酵第7天硝酸盐含量下降为（886.94±96.26） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵豌豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中g。枯草芽孢杆菌发酵豌豆在第3天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量为（1.85±0.12） mg/kg，发酵第7天为（1.99±0.56） mg/kg。发酵豌豆硝酸盐含量先下降后上升，第3天硝酸盐含量为（1 061.01±46.09） mg/kg，发酵第7天硝酸盐含量为（1 951.64±61.38） mg/kg。

枯草芽孢杆菌发酵扁豆亚硝酸盐和硝酸盐含量变化见图2中h。枯草芽孢杆菌发酵扁豆在第3天和第5天出现亚硝峰，亚硝酸盐含量分别为（1.63±0.14） mg/kg和（1.47±0.44） mg/kg，第7天为（1.10±0.34） mg/kg。扁豆发酵第5天硝酸盐含量达到最低值（355.51±28.84） mg/kg，随后迅速上升，最终第7天硝酸盐含量为（706.73±71.18） mg/kg。

不同豆类原料中亚硝酸盐含量差异显著，枯草芽孢杆菌发酵豆子亚硝峰的出现时间存在差异[20]。黄润秋等[21]发现泡菜萝卜的亚硝峰出现在第1天，而泡菜莴笋的亚硝峰出现在第2天。亚硝酸盐含量下降是由于枯草芽孢杆菌在发酵过程中代谢产生亚硝酸还原酶，亚硝酸盐被降解[22]。此外，枯草芽孢杆菌还具有硝酸还原酶活性，可将硝酸盐转化为亚硝酸盐[23]，但是发酵豆类硝酸盐含量依然保持较高水平，可能是由于枯草芽孢杆菌发酵增加了豆类中酚类物质，多酚可以抑制硝酸还原酶活性[24]。枯草芽孢杆菌发酵豆类过程中亚硝酸盐含量始终低于GB 2762—2017中规定的亚硝酸盐最大残留量20 mg/kg。高梦颖等[25]比较研究了自然接种和人工接种枯草芽孢杆菌对发酵豆豉中亚硝酸盐含量的影响，研究结果表明无论自然接种还是人工接种，发酵豆豉亚硝酸盐含量均逐渐上升，且人工接种组亚硝酸盐含量均高于自然接种组。

2.2 干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌生长曲线和亚硝酸还原酶活性

由图3可知，干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌在0～2 h处于迟缓期，2 h左右开始进入对数生长期，14 h左右进入稳定期。由图4可知，干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌均具有亚硝酸还原酶活性，且处于对数生长期的干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的亚硝酸还原酶活性略高于其他生长阶段。干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌中亚硝酸还原酶活性是豆子发酵過程中降低亚硝酸盐含量的重要基础。

3 结论

干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌均具有亚硝酸还原酶活性。利用干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌人工接种发酵8种不同的豆子，整个发酵过程中亚硝酸盐含量均低于GB 2762—2017中规定的最大残留量20 mg/kg。干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌是发酵制备不同豆制品的理想菌株，亚硝酸盐含量控制合理，具有良好的食品安全性。

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