核酸酶在酱油酿造上的应用研究

赵悦 丁婷婷 张梦丽 冯怡华 王春玲

摘要：该研究采用低盐固态酱油发酵工艺，采用单一菌株（米曲霉3.042）进行制曲，在制曲过程中添加核酸酶来实现酶法辅助发酵。采用单因素实验确定核酸酶的最佳添加量和添加时间。通过测定酱醅的总酸、氨基酸态氮等理化指标以及成品酱油中的风味成分，最后进行成品酱油的感官评定，探讨外源核酸酶在酱油酿造中的作用。结果表明，核酸酶的最佳添加量为大曲质量的0.3%。同时核酸酶的添加提高了大曲的酶活，保证了原料中大分子物质的分解和有效利用，从而具有提高酱油原料利用率和改善酱油风味的效果。

关键词：低盐固态酱油；核酸酶；酶活；理化特性；风味；感官评定

中图分类号：TS264.21      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0006-06

Application of Nuclease in Soy Sauce Brewing

ZHAO Yue， DING Ting-ting， ZHANG Meng-li， FENG Yi-hua， WANG Chun-ling*

（College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and

Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： In this study， low-salt solid-state soy sauce fermentation process is used， a single strain （Aspergillus oryzae 3.042） is used for koji making， and nuclease is added during the koji making process to achieve enzymatic-assisted fermentation. Single factor experiment is used to determine the optimal addition amount and time of nuclease. The total acid， amino acid nitrogen and other physical and chemical indexes of soy sauce mash as well as the flavor components in the finished soy sauce product are measured， and the sensory evaluation of the finished soy sauce product is carried out， in order to discuss the effect of exogenous nuclease in soy sauce brewing. The results show that the optimal addition amount of nuclease is 0.3% of the mass of Daqu. At the same time， the addition of nuclease improves the enzyme activity of Daqu， ensures the decomposition and effective utilization of macromolecular substances in raw materials， so as to improve the utilization rate of soy sauce raw materials and improve the flavor of soy sauce.

Key words： low-salt solid-state soy sauce; nuclease; enzyme activity; physical and chemical properties; flavor; sensory evaluation

收稿日期：2023-02-20

基金項目：国家重点研发计划（2018YFC1604102）;企业合作课题（FXZL-CYZX-2022-006）

作者简介：赵悦（1998－），女，硕士，研究方向：生物与医药。

通信作者：王春玲（1977－），女，教授，博士，研究方向：食品营养与安全。

酱油是由大豆（或脱脂大豆）等富含蛋白质的原料和面粉（或麦麸）等富含淀粉的原料经高温蒸煮，在曲霉分泌的多种酶系的作用下，经过细菌、酵母菌等微生物的长时间发酵而制成的一种调味品[1]。低盐固态发酵酱油是以豆粕和麸皮为原料，经过浸泡蒸煮、制备大曲、添加盐水等步骤制作而成的酱油，其工艺特点是设备简单、生产时间短、生产成本较低，大多数酱油生产企业将低盐固态发酵工艺作为传统特色加以保留，但此类工艺缺点比较明显，如产品香气不足[2]，酿造出来的产品品质欠佳等。

为了弥补不足，通过添加外源酶制剂达到补充成曲酶系的目的，使后期发酵原料的利用更彻底，提高出油率和酱油质量[3]。本研究通过在大曲制作过程中添加核酸酶来考察其对酱醅理化指标和酱油成品指标的影响，以探讨核酸酶的添加对成品酱油风味和感官的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

原料：豆粕、麸皮；菌种：米曲霉沪酿3.042。

1.2 试剂

PDA培养基、麦芽汁培养基（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；硼酸、甲醛（均为分析纯）：博欧特（天津）化工贸易有限公司；硫酸、盐酸（均为分析纯）：天津市化学试剂一厂。

1.3 主要仪器与设备

生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；pH计 德国赛多利斯公司；酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司；气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司；自动凯氏定氮仪 山东海能科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 发酵工艺

采用低盐固态发酵方法生产酱油，以大曲∶盐水为1∶1的比例配制12%的盐水，将其混匀后放入培养箱中进行培养。发酵条件：在43 ℃的恒温条件下连续发酵10 d，然后将培养箱温度降至33 ℃再发酵18 d，总周期为28 d[4]。

1.4.2 酶活的测定

核酸酶活力根据GB/T 34222－2017的方法进行测定。

1.4.3 理化指标的测定

取5 g酱醅，将其充分研磨，用蒸馏水定容至50 mL，然后在3 900 r/min的条件下用离心机离心10 min，之后取出上清液用于后续理化指标的测定。pH值的测定：使用pH计；总酸、氨基酸态氮、全氮含量的测定：分别参照GB/T 12456－2008、GB 5009.235－2016、GB/T 18186－2000；还原糖含量的测定：使用DNS法。

1.4.4 成品指标的测定

1.4.4.1 氨基酸态氮生成率的计算

氨基酸态氮生成率（%）=ANTN×100%。

式中：AN表示氨基酸态氮含量，g/dL；TN表示全氮含量，g/dL。

1.4.4.2 蛋白质利用率的计算

蛋白质利用率（%）=（m1×TN1d1+m2×TN2d2）×6.25m'×100%。

式中：m1、m2表示酱油头油、二油的产量，kg；TN1、TN2表示酱油头油、二油的全氮含量，g/dL；d1、d2表示酱油头油、二油的相对密度；m'表示混合原料蛋白质总量，kg；6.25表示全氮折算蛋白质的系数[5]。

1.4.5 风味物质的测定

利用固相微萃取-气质联用（SPME-GC-MS）技术探究酱油中的风味物质。

1.4.6 感官评定方法

将头油和二油按1∶1进行配兑，沉降数天后，于65 ℃巴氏杀菌30 min。采用七点线性标度来反映酱油感官特征（颜色、气味、味道、体态）的强度。表1中，1～7代表酱油的感官特征强度逐步提高[6]。

2 结果与分析

2.1 核酸酶添加时间点的确定

采用低盐固态方法发酵，总发酵时长为28 d，并分别于第0，7，14，21，28天取样。选取大曲制作过程中的0，12，24，36 h为添加时间点，探究核酸酶的最佳添加时间。

2.1.1 pH值的测定

随着发酵的进行，微生物将蛋白质分解为氨基酸，由于有机酸的生成，酱醅中的酸类物质不断累积，使其pH值发生改变。发酵过程中pH值的变化见图1。

由图1可知，空白组与实验组的pH值都随着时间的增加而降低，前7 d下降迅速，发酵后期下降缓慢，终端pH在5.0左右。

2.1.2 总酸含量的测定

酸类物质对酱油的风味有一定的贡献。发酵期间总酸含量的变化见图2。

由图2可知，发酵前7 d，总酸含量快速增长，而发酵7 d后，总酸含量增长速度明显降低。发酵结束时，24 h添加核酸酶组的总酸含量高于其他组，为1.79 g/dL；而空白组的总酸含量低于其他组，为1.67 g/dL。

2.1.3 氨基酸态氮含量的测定

氨基酸态氮是影响酱油品质的一个关键因素。酱油品质的优劣往往依据氨基酸态氮的水平来判定。发酵期间氨基酸态氮含量的总体变化情况见图3。

在整个发酵周期内，氨基酸态氮含量随着时间的增加而增加。由图3可知，将实验组与空白组相比较，氨基酸态氮含量最高的一组是0 h添加核酸酶组，为0.922 g/dL，较氨基酸态氮含量为0.857 g/dL的空白组提高了7.6%。

2.1.4 全氮含量的测定

全氮是衡量酱油品质的另一个关键因素。全氮含量越高，意味着酱油中所含的蛋白质、氨基酸、肽等物质的含量越高。发酵期间全氮含量的变化情况见图4。

由图4可知，在发酵0～7 d内，全氮含量以较快的速度不断增长，之后增长速度逐渐放缓，但在21 d后又出现小幅上升趋势。其中0 h添加核酸酶组的全氮含量在发酵过程中普遍高于其他组，在发酵终端28 d时，全氮含量为1.824 g/dL，所以确定大曲制作过程中的0 h为核酸酶的最佳添加时间。

2.2 添加核酸酶制曲对酶活力的影响

酶活力的高低关乎原料的分解利用程度。酶活力过低，原料分解利用不充分，影响原料的利用率和酱油的风味。因此，适当提高酶活力有助于改善酱油的质量。基于大曲中核酸酶的本底酶活、外源核酸酶的酶活以及核酸酶的溶解性考虑[7]，最终将核酸酶的添加量定为0.05%、0.3%和0.5%。在大曲制作过程中的24，36，42，48 h分别取样，测定空白组与分别添加大曲质量0.05%、0.3%和0.5%核酸酶實验组的酶活力变化情况，见图5。

由图5可知，对于核酸酶而言，空白组与实验组均呈现先上升后下降的趋势，并在42 h达到最高。其中空白组酶活力最高值为656 U/mg；0.05%实验组酶活力最高值为711 U/mg，较空白组提高了8%；0.3%实验组酶活力最高值为788 U/mg，较空白组提高了20%；0.5%实验组酶活力最高值为845 U/mg，较空白组提高了29%。

2.3 添加核酸酶制曲对理化指标的影响

核酸酶不仅可使RNA水解，而且能够将DNA中所含有的磷酸二酯键水解，从而获得5'-核苷酸。鲜味的增强往往与呈味核苷酸含量的提高密切相关[8]。以核酸酶为研究对象，添加量分别为大曲原料质量的0.05%、0.3%和0.5%，探究不同组别之间的理化差异。

2.3.1 pH值的测定

由图6可知，空白组与实验组的pH值都随着时间的增加而降低，前7 d下降迅速，发酵后期下降缓慢，终端pH在5.20左右。

2.3.2 总酸含量的测定

由图7可知，总酸呈现先快速上升后缓慢上升的趋势，发酵过程中，添加0.05%核酸酶组的总酸含量较其他组高，在发酵终端其总酸含量为1.759 g/dL，较总酸含量为1.69 g/dL的空白组提升了4%。

2.3.3 氨基酸态氮含量的测定

由图8可知，发酵过程中，氨基酸态氮含量随着时间的增加先急速增加后缓慢增加。在28 d时，添加0.3%核酸酶组的氨基酸态氮含量最高，为0.830 3 g/dL，较氨基酸态氮含量为0.787 2 g/dL的空白组提升了5%。由此可见，添加核酸酶能够在一定程度上提高氨基酸态氮含量。

2.3.4 全氮含量的测定

由图9可知，全氮含量随着时间的延长而增加。发酵前7 d，全氮含量上升较快，后期增加缓慢。发酵终端空白组与实验组并无明显差异。

2.3.5 还原糖含量的测定

由图10可知，发酵前14 d，还原糖含量随着时间的增加而增加；14 d后，还原糖含量有所下降。发酵过程中，实验组的还原糖含量均较空白组有所提升，其中添加0.5%核酸酶组的还原糖含量较高于其他组，在14 d时含量最高，为2.895 g/dL，高于空白组16%。而添加0.05%核酸酶组的还原糖含量较空白组提升了8%；添加0.3%核酸酶组的还原糖含量较空白组提升了12%。

2.4 添加核酸酶制曲对成品指标的影响

2.4.1 氨氮转化率的计算

氨氮转化率为氨基酸态氮含量与全氮含量的比值。氨氮转化率越高，意味着原料中的蛋白质水解越充分，所生成的氨基酸态氮含量越高。4组成品酱油的氨氮转化率见图11。

由图11可知，对于氨氮转化率而言，添加0.3%核酸酶组的氨氮转化率最高，达到65%，较空白组提高了10%。由此可见，添加适量的核酸酶可以显著促进原料分解，保证原料中大分子物质的有效利用。

2.4.2 蛋白质利用率的计算

蛋白质利用率是衡量成品酱油中蛋白质被分解利用生成其他物质多少的一个重要参数。蛋白质利用率高，意味着原料在酶的作用下被充分分解利用。对于企业而言，成品酱油的蛋白质利用率越高，往往代表着公司的经济效益越好。4组成品酱油的蛋白质利用率见图12。

由图12可知，4组酱油的蛋白质利用率分别为79.08%、85.97%、88.03%、83.64%。4组酱油中蛋白质利用率最高的为添加0.3%核酸酶的实验组，较空白组提高了8.95%。由此可见，核酸酶的添加对于酱油蛋白质利用率的提高有促进作用，这表示添加核酸酶有助于充分发挥酶系作用，促进原料在微生物的作用下被进一步分解利用。以上述分析为基础，确定核酸酶的最佳添加量为0.3%。

2.5 添加核酸酶制曲对酱油风味的影响

固相微萃取-气质联用仪分析表明，空白组共有59种风味物质，包括10种醇类、16种醛类、5种酸类、5种酯类、11种酮类、2种酚类、6种吡嗪类、3种烃类、1种其他类物质。而添加0.3%核酸酶组共发现57种风味物质，包括12种醇类、15种醛类、5种酸类、4种酯类、9种酮类、2种酚类、7种吡嗪类、2种烃类、1种其他类物质。

由图13可知，添加0.3%核酸酶组风味物质的相对含量较空白组而言，醇类、醛类、酸类、酚类物质的相对含量均有较大提升，同时酯类、酮类、吡嗪类等物质的相对含量与空白组相差不大。由此可见，添加核酸酶制曲后，虽然风味物质数目与空白组相差不大，但是大部分风味物质的相对含量较空白组有了显著增加。

由图14中a可知，空白组主要分布在二、三象限，添加0.3%核酸酶组主要分布在一、四象限，两类样本得到了很好的分离。为了更清楚地找到引起差异的典型风味物质，采用S-plots分析，共找到了12种符合条件的差异性物质。对差异性风味物质进行聚类分析，其中包含4种醇类物质，分别为苯乙醇、1-辛烯-3-醇、异戊醇、2-甲基丁醇；4种醛类物质，分别为2-甲基丁醛、异戊醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛；3种酸类物质，分别为醋酸、2-甲基丁酸、异戊酸；酚类物质为愈创木酚。其中，添加0.3%核酸酶组中相对含量较高的苯乙醇是对酱油风味有重要作用的醇类化合物，它能赋予酱油花香[9]；具有蘑菇香的1-辛烯-3-醇是酱油中较重要的风味物质[10]；2-甲基丁酸源于氨基酸的降解，具有奶酪香，是酱油中主要的香气活性物质[11]；异戊醛可以为酱油带来少许的水果香[12]；愈创木酚可以赋予酱油独特的烟熏味，从而达到减少其咸味的作用[13]。由此可见，添加适量的核酸酶有助于增加酱油中的花香、水果香等香气成分。这是由于核酸酶可以水解核酸中的磷酸二酯键，从而生成5'-核苷酸，而5'-GMP和5'-AMP作为相应的产物，具有明显改善风味特性的作用[14]。

2.6 添加核酸酶制曲对酱油感官的影响

由表2可知，添加0.3%核酸酶組的总分最高，在麦芽香、酱香、鲜味等方面较空白组有较大提升，这与核酸酶添加后酱油风味的改善密切相关[15]。

上述结果在图15中也有所体现。这与分析的理化结果相一致，因此确定核酸酶的最佳添加量为0.3%。

3 结论

本文研究了在低盐固态发酵工艺下，在大曲制备时不同添加量的核酸酶对大曲酶活、酱醅理化指标及酱油成品指标的影响，最终确定核酸酶的最佳添加量为大曲质量的0.3%。添加0.3%核酸酶组较空白组而言，氨基酸态氮含量和还原糖含量均有所提升，氨氮转化率提高了10%，蛋白质利用率提高了8.95%，同时醇类、醛类、酚类等风味物质的相对含量有所提高，在感官上麦芽香和酱香等方面得分略高。因此，在酱油酿造过程中添加核酸酶具有一定的推广应用价值。

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