玉米小分子肽在赖氨酸发酵中应用探究及工艺优化

王金多 李澜潇 徐庆阳

摘要：为了降低赖氨酸发酵生产过程中“三废”的排放，减少成分复杂的玉米浆对发酵液的影响，提高分离提取良品率，该研究优化了L-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌LS260的发酵条件，通过氮源分析，采用近似等效替代法，使用玉米小分子肽替代玉米浆，通过5 L生物反应器发酵试验探究清洁发酵工艺的可行性，通过单因素试验、响应面优化试验进一步优化了培养基营养成分，结合营养适量流加发酵控制工艺，确定了最适合LS260的发酵条件。结果显示，通过氮源等效替代试验，赖氨酸产量为124 g/L，转化率提高至71.5%；通过营养适量流加工艺将产量提高至136 g/L，发酵上清液透光率提高至84.4%；由单因素试验、响应面法优化试验可知，生物素、KH2PO4的最适添加量分别为3.2 mg/L、4.11 g/L，最适接种量为25.49%。在试验所得的最适条件下，赖氨酸产量达到160.3 g/L，转化率达到71.5%。结果显示，最终产量和转化率与模型数值基本相符，发酵液上清液透明度大幅降低，为提取工艺进一步优化创造了条件，试验结果具有较好的工业应用前景。

关键词：L-赖氨酸；玉米小分子肽；清潔发酵；谷氨酸棒杆菌；响应面优化

中图分类号：TS211.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0018-06

Application and Process Optimization of Maize Small-Molecule Peptides in Lysine Fermentation

WANG Jin-duo1，2，3， LI Lan-xiao1，2，3， XU Qing-yang1，2，3*

（1.College of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China;

2.National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation

Technology， Tianjin 300457， China; 3.Tianjin Engineering Laboratory of Efficient

and Green Amino Acid Manufacturing， Tianjin 300457， China）

Abstract： In order to reduce the emission of “three wastes” in the lysine fermentation production， reduce the effect of corn pulp with complex components on the fermentation broth， and improve the separation and extraction rate， in this study， the fermentation conditions of L-lysine producing bacterium Corynebacterium glutamicum LS260 is optimized. Through nitrogen source analysis， the approximate equivalent substitution method is adopted to replace corn pulp with maize small-molecule peptides， and the feasibility of clean fermentation process is explored through 5 L bioreactor fermentation test. The nutrients of the medium are further optimized by single factor test and response surface optimization test， and the optimal fermentation conditions for LS260 are determined by combining the nutrient-appropriate flow-adding fermentation control process. The results show that through the nitrogen source equivalent substitution test， the yield of lysine is 124 g/L and the conversion rate increases to 71.5%. The yield increases to 136 g/L and the light transmittance of fermentation supernatant increases to 84.4% by nutrient-appropriate flow-adding process. According to single factor test and response surface method optimization test， the optimal addition amount of biotin and KH2PO4 is 3.2 mg/L and 4.11 g/L respectively， and the optimal inoculation amount is 25.49%. Under the optimal conditions， the yield of lysine reaches 160.3 g/L and the conversion rate reaches 71.5%. The results show that the final yield and conversion rate are basically consistent with the model values， and the transparency of fermentation broth supernatant is greatly reduced， which has created conditions for further optimization of the extraction process. The test results have a good prospect for industrial application.

Key words： L-lysine; maize small-molecule peptide; clean fermentation; Corynebacterium glutamicum; response surface optimization

收稿日期：2023-02-24

基金项目：天津市合成生物技术创新能力提升行动计划项目（TSBICIP-KJGG-005-08）；山东省重点研发计划（2021ZDSYS10）；天津市科技计划项目（21ZYQCSY00050）

作者简介：王金多（1997－），男，硕士，研究方向：代谢工程与发酵过程控制。

通信作者：徐庆阳（1980-），男，研究员，博士生导师，博士，研究方向：代谢工程与发酵过程控制。

L-赖氨酸作为人和动物的八大必需氨基酸之一，在医疗、畜牧业及食品工业中得到了广泛的應用[1]。在饲料中添加赖氨酸，能够促进牲畜的生长速度，改善饲料中氨基酸平衡，提高饲料和蛋白质资源的利用效率，提高出栏率并减少饲养成本。饲料中添加适量的赖氨酸能够提高出栏时牲畜的肉质及瘦肉率，亦可增强经济动物的抵抗力。由于分解法和化学合成法制得的赖氨酸很难达到兽用标准，不能直接产出，现多通过发酵法生产赖氨酸，但在发酵过程中多采用营养丰富但成分复杂的农业副产物，如：玉米浆、大豆蛋白水解液、糖蜜等，但受季节、产地、作物品种等变化导致的发酵培养基成分波动在一定程度上影响菌体的生长和产酸[2]，且在产物分离提取过程中，由于农业副产物中常含有大量色素、杂蛋白，造成提取过程中耗水、耗电；产生的固形废物、含盐废水亦会对周围土地及水环境产生恶劣影响。赖氨酸的发酵过程属于典型的高密度发酵，菌体在积累赖氨酸的过程中受到多个关键酶的共同调控[3]。在分析玉米浆、糖蜜、大豆蛋白水解液主要组分后，探究使用成分稳定且环境友好的玉米小分子肽做近似等效替代，探究清液发酵在赖氨酸生产方面的可行性。

1 材料与方法

1.1 菌种

谷氨酸棒杆菌LS260：保藏于天津科技大学代谢工程研究室。

1.2 培养

1.2.1 种子培养基

葡萄糖80 g/L，玉米浆干粉20 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 6 g/L，KH2PO4 1.7 g/L，MgSO4 0.6 g/L，VB1 1.5 mg/L，VB5 1.5 mg/L，VB12 1.5 mg/L，VH 2 mg/L。

1.2.2 对照发酵培养基

葡萄糖60 g/L，玉米浆干粉25 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO4 4 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 1 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH 1.5 mg/L。

1.2.3 清液发酵培养基

葡萄糖60 g/L，玉米小分子肽25 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO4 4 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 1 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH 1.5 mg/L，FeSO4·7H2O 50 mg/L，MnSO4·H2O 110 mg/L，CuSO4·5H2O 2 mg/L，ZnSO4 10 mg/L，PLP 5 mg/L。

1.2.4 流加培养基

玉米小分子肽7 g/L，VB1、VB3、VB5、VB12 分别为2.5 mg/L，VH 2 mg/L，甜菜碱 3 g/L，氯化胆碱 4 g/L。

1.2.5 斜面培养基

葡萄糖1 g/L，酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO4 4 g/L，MgSO4 1 g/L。

1.3 主要仪器

仪器与设备见表1。

1.4 培养方法

斜面培养：一代试管斜面活化2支，恒温箱32 ℃培养24 h，二代茄形瓶斜面活化2支，恒温箱32 ℃培养18 h。

种子罐培养：接种量2支茄形瓶，发酵体积2 L，培养温度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧45%以上，转速与溶氧联动，种子培养12～15 h。

发酵罐培养：接种量600 mL，发酵体积3 L，培养温度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧30%以上，转速与溶氧联动，发酵时间36 h。

1.5 检测方法

1.5.1 pH值测定

梅特勒pH在线检测，精密pH试纸辅助检测。

1.5.2 菌体生物量测定

菌体生物量采用OD600 nm吸光度法测定，发酵液用容量瓶稀释特定倍数后，用可见光分光光度计测定吸光度，吸光度×稀释倍数得到实际OD值，可以直接表示菌体生物量[4]。

1.5.3 L-赖氨酸含量测定

发酵液中L-赖氨酸及副产物含量采用高效液相色谱法测定，采用Agilent C18色谱柱（15 mm×4.6 mm，3.5 μm），衍生剂为2，4-二硝基氟苯，柱前衍生[5]，流动相为50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸钠溶液，柱温33 ℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm。

1.5.4 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定。

1.6 糖酸转化率计算方法

糖酸转化率SA计算公式：

SA（%）=ρ×Vm×100%。

式中：ρ为L-赖氨酸质量浓度，g/L；V为发酵液总体积，L；m为总耗糖量，g。

所有试验数据取3次试验的平均值。单因素方差分析后采用Dunnett-t检验来确定数据差异的显著性（P<0.05）[6]。

1.7 響应面试验设计

Box-Behnken中心组合试验：采用Box-Behnken中心组合试验进行试验条件优化，以生物素添加量（A）、KH2PO4添加量（B）、接种量（C）为自变量，以L-赖氨酸产量为响应值，通过响应面试验进行发酵条件优化。

1.8 单因素试验设计

单因素试验设计见表2。

2 结果与讨论

2.1 玉米浆与玉米小分子肽灭菌后蛋白含量对比分析

玉米浆作为赖氨酸发酵过程中最重要的氮源之一，对菌体生长起着决定性作用。而玉米浆中的杂蛋白是影响发酵过程中菌体代谢和后提取过程中离子交换树脂寿命的重要因素，杂蛋白的含量越高，赖氨酸成品的良品率越低。所以，选择成分稳定、蛋白含量低、色素含量少的氮源非常重要。

因生物来源类似，选取玉米小分子肽作为赖氨酸发酵中玉米浆氮源的替代物质。为了对比玉米小分子肽和玉米浆的蛋白质含量，通过凯氏定氮法测定蛋白质含量，结果见图1。

经过水解处理后的玉米小分子肽蛋白质含量更少。一次灭菌后，玉米浆的蛋白质含量比玉米小分子肽高129%。玉米浆杂蛋白含量过高，在发酵过程中菌体要代偿性分解蛋白质以获取生长必需的氮源[7]，剩余的蛋白质在赖氨酸提取过程中容易导致产品质量不合格，杂质超标，故玉米小分子肽作为发酵原料效果更优。

2.2 玉米浆与玉米小分子肽灭菌后不同氨基酸含量对比分析

赖氨酸发酵是典型的生长偶联型，相对于成分复杂且需要主动分解的蛋白质而言，单分子氨基酸更容易被菌体利用，发酵接种后更容易适应发酵培养基，延滞期更短，对数期生长速率更快，产酸速率更快，能够有效提高菌体活力。

通过氨基酸分析仪对比玉米浆和玉米小分子肽中各种游离氨基酸含量，结果见图2。

通过氨基酸分析仪对比分析，玉米浆与玉米小分子肽的氨基酸含量有较大区别[8-9]，玉米小分子肽大部分氨基酸含量比玉米浆高，主要是天冬氨酸高41.7%，苏氨酸高7.3%，丝氨酸高58.4%，甘氨酸高28.6%，苯丙氨酸高69.3%，组氨酸高21.7%，丙氨酸高23.7%，缬氨酸高6.3%，异亮氨酸高8.6%，亮氨酸高11.5%；玉米小分子肽中的谷氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸相较于玉米浆含量稍低。

2.3 清洁发酵培养基与传统培养基发酵对比探究

为了确定玉米小分子肽在赖氨酸发酵过程中的效果和对主要发酵参数的影响，从菌体量、产酸量、转化率、色素含量几个角度与传统发酵培养基进行对比，从而确定进一步优化的可行性。

以传统发酵培养基为对照组，清洁发酵培养基为试验组。由图3可知，从菌体的生长曲线看，采用传统发酵培养基的对照组的生长速率和最高菌体量明显高于试验组，对照组的最高OD600 nm为141.6，相较试验组的107.2高24.29%，在生长稳定期后，试验组的生物量下降速率比对照组高50%；L-赖氨酸的产量与菌体生长曲线走势相似，产酸速率随着菌体生长速率的变化而变化，发酵前期，试验组的生长速率明显高于对照组，发酵10 h后，对照组的生长速率明显高于试验组，对照组最终产量为159 g/L，试验组最终产量为124 g/L，相较于对照组下降22.01%。对照组培养基天然成分丰富，且培养基中维生素[10]、微量元素、生长因子等高于试验组[11]。从产酸曲线可以看出，在发酵前期，试验组的产酸速率明显高于对照组，且整体产酸速率相对稳定，说明发酵接种后，菌体能更好、更快地适应组分稳定、均一清洁培养基。赖氨酸的发酵过程是严格的生长偶联型，且生长速率的下降势必引起产酸速率下降，发酵前期，试验组的生长速率与对照组相比相差无几，但在中后期的生长维持上低于对照组，所以解决试验组发酵中后期的菌体活力维持是主要问题。

由表3可知，试验组的糖酸转化率较对照组高3.6%；试验组发酵上清液透光率较对照组提高了25.6%。尽管选用清洁发酵培养基的产量不及传统培养基，但是糖酸转化率有一定的提高，考虑原因可能是用于菌体生长的碳代谢流向产赖氨酸；对照组发酵培养基中含有较多的生物素，生物素的添加量与菌体的合成速度及厚度呈正相关。试验组发酵培养基中生物素含量较低，有利于赖氨酸的外排，减小胞内反馈抑制，促进碳代谢流向有益于赖氨酸合成方向。试验组发酵上清液透光率较对照组提高了25.6%，后提取过程中，活性炭和水的用量可大大降低。

2.4 营养流加对赖氨酸清洁发酵的影响

为解决使用玉米小分子肽进行赖氨酸发酵菌体量不足、发酵后期菌体活力不足的问题，采用营养流加的策略进行发酵优化。试验组从发酵10 h开始进行营养流加，流加速度为100 mL/h，试验结果见图4。

由图4可知，以清洁发酵培养基为对照组，清洁发酵培养基配合营养流加为试验组。试验组在2.3的基础上，于发酵10 h开始流加1.2.4中的流加培养基，以解决发酵中后期营养不足引起的菌体生长停滞及活力下降问题。在发酵0～10 h，试验组与对照组菌体的生长速率、产酸水平近似相同，开始流加后，试验组最高OD600 nm为129，试验组的最终产量为136 g/L，产量较对照组提高9.68%。菌体生长对数期延长约4 h左右，在14 h后，菌体处于低速生长的稳定期，虽产酸速率有所降低，但整体的产酸速率和产量相较于对照组有大幅提高。

2.5 赖氨酸清洁发酵工艺优化单因素试验

影响谷氨酸棒杆菌发酵生产赖氨酸过程中，菌体的生长周期及生长状态对赖氨酸产量及产率的影响极为重要，除了碳源、氮源外，影响发酵过程中菌体生长周期及状态的主要因素为生物素、KH2PO4的添加量和接种量[12]。

图5中A、B、C、D、E 5个水平分别对应表3中1，2，3，4，5 5个水平。由图5可知，添加适量的生物素有益于菌体生长，当生物素添加量过高时，可能导致细胞膜生长更致密，不利于赖氨酸外排。生物素添加量为3 mg/L时，赖氨酸产量最优，为127 g/L；KH2PO4能够为菌体生长提供必需的钾离子和磷酸根，对菌体渗透压的维持及细胞膜的合成有重要作用，当磷酸盐添加量为4 g/L时，赖氨酸产量达到126 g/L；接种量在发酵控制过程中是除温度、pH、溶氧外最重要的控制参数之一[13-15]，合适的接种量对发酵各阶段的影响较显著，是调节发酵各阶段所需时间、缩短菌体延滞期、延长对数期的重要策略，对缓解菌体早衰、延长产酸期、提高糖酸转化率有一定效果，试验选取5个接种量水平，接种量25%为最优，此时赖氨酸产量为137 g/L。

2.6 发酵条件响应面试验优化分析

在单因素试验的基础上，以生物素添加量（A）、KH2PO4添加量（B）、接种量（C）为自变量，以L-赖氨酸产量为响应值，通过响应面试验进行发酵条件优化，响应面试验设计及结果见表4。

以L-赖氨酸产量为响应值，生物素添加量（A）、KH2PO4添加量（B）、接种量（C）为自变量，建立回归方程Y（赖氨酸）=157.40+5.63A+3.00B+2.63C－4.50AB－4.75AC+2.00BC－11.83A2－10.08B2－9.82C2。

由表5可知，此模型的P值＜0.000 1，说明通过该回归模型的设计所得试验结果均影响极显著，失拟项的P值=0.541 3＞0.05，说明该回归曲线的拟合度良好，具有较高的可信度。回归方程的决定系数R2为0.984 271，回归方程的校正决定系数RAdj2为0.964 048。由P值可知，该模型的一次项A、B，二次项A2、B2、C2，交互项AB、AC对结果的影响极显著；一次项C对结果的影响显著；交互项BC对结果的影响不显著。由F值可以确定3个因素对赖氨酸产量的影响大小顺序为生物素添加量＞KH2PO4添加量＞接种量。测量信噪比为20.585，信号充足，表明该模型可以应用于试验设计。

各因素交互作用对赖氨酸产量影响的响应面及等高线见图6。

由图6可知，赖氨酸的产量随着各自变量数值的不断增加呈现先升高后降低的趋势，说明两因素间存在一定交互作用，其中AB曲面弯曲程度最大，等高线更接近椭圆形，说明AB交互作用的影响极显著。

通过响应面软件对方程求解，得到最佳发酵条件为生物素添加量（A）3.20 mg/L、KH2PO4添加量（B）4.11 g/L、接种量（C）25.49%。结合分批补料发酵操作过程中的特殊性，接种量调整为25%。在此发酵条件下，赖氨酸的实际产量为160.3 g/L，与优化所得理论值相近，说明该方案具有可行性。

3 结论

通过不同碳源的成分对比分析，采用近似等效替代的方法得到一种效果相近的清洁发酵培养基，通过5 L生物反应器发酵试验探究清洁发酵培养基的可行性，最终产量为124 g/L，转化率提高至71.5%；通过营养流加进一步提高产量至136 g/L。

利用单因素试验结合响应面优化对赖氨酸清洁发酵培养基中对菌体生长及产酸影响显著的成分添加量进行优化，得到了最优发酵条件：生物素添加量3.20 mg/L、KH2PO4添加量4.11 g/L、接种量25.49%。结合营养流加工艺，赖氨酸的实际产量为160.3 g/L。

试验得到的赖氨酸的清洁发酵方法在赖氨酸发酵工业有一定的应用前景，不仅能提高兽用赖氨酸的品质，主要優势表现在后提取过程中能大量节省活性炭和水，而且能提高离子交换树脂的使用寿命及成品的良品率，符合发酵工业的未来发展方向和“双碳”发展理念。

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