黑曲霉液体发酵制备苦荞膳食纤维及降脂活性研究

刘有志 刘国厂 于长生

摘要：苦荞食药兼用，具有抗氧化、降血糖和抗动脉硬化等多种生物活性功效，苦荞中富含膳食纤维，目前膳食纤维的研究主要集中于加工工艺和生物活性方面，对发酵苦荞膳食纤维和生物活性的研究较少，该试验基于此，利用黑曲霉液体发酵技术，对苦荞膳食纤维进行加工发酵，并对发酵后的苦荞膳食纤维营养物质和降脂功效进行研究。研究结果表明，发酵前后苦荞膳食纤维中的蛋白质、水分和脂质含量基本保持不变，膳食纤维的总含量基本稳定，但发酵后苦荞膳食纤维中的不可溶性膳食纤维减少，可溶性膳食纤维增加；发酵后苦荞膳食纤维的持水力、持油性和膨胀力均得到了提高，调节高脂饮食小鼠肠道中微生物群落结构能力得到了增强，为发酵型苦荞膳食纤维的功能应用提供了理论基础。

关键词：膳食纤维；降脂功效；苦荞；基因组分析

中图分类号：TS210.9      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0081-04

Preparation of Tartary Buckwheat Dietary Fiber by Liquid Fermentation of

Aspergillus niger and Study on Its Lipid-Lowering Activity

LIU You-zhi1， LIU Guo-chang2， YU Chang-sheng1

（1.Yongcheng Vocational College， Yongcheng 476600， China; 2.Huanghe S & T

University， Zhengzhou 450006， China）

Abstract： Tartary buckwheat is used as both food and medicine， and has multiple bioactive functions such as anti-oxidation， regulating blood sugar level and anti-arteriosclerosis. Tartary buckwheat is rich in dietary fiber. At present， the research on tartary buckwheat dietary fiber is mainly focused on processing technology and biological activity， with less research on fermented tartary buckwheat dietary fiber and biological activity. Based on this， in this test， Aspergillus niger liquid fermentation technology is used to process and ferment tartary buckwheat dietary fiber， and the nutrients and lipid-lowering effect of the fermented tartary buckwheat dietary fiber are studied. The results show that the content of protein， water and lipid before and after fermentation remains unchanged basically， the total content of dietary fiber is basically stable， but the insoluble dietary fiber in the fermented tartary buckwheat dietary fiber decreases， the soluble dietary fiber increases. After fermentation， the water holding capacity， oil holding capacity and expansibility of tartary buckwheat dietary fiber are all improved， and the ability to regulate the microbial community structure in the gut of mice with high-fat diet is enhanced， which has provided a theoretical basis for the functional application of fermented tartary buckwheat dietary fiber.

Key words： dietary fiber; lipid-lowering effect; tartary buckwheat; genome analysis

收稿日期：2023-02-18

基金項目：2018年度河南省社科联规划类型项目（SKL-2018-2810）

作者简介：刘有志（1982-），男，讲师，硕士，研究方向：运动训练与食品营养。

苦荞食药兼用[1]，在我国被广泛栽培。近些年的研究结果表明[2—3]，苦荞中富含有营养价值和药理价值的成分[4]，也是制作苦荞醋等调味品的基本原料[5—7]。

苦荞醋是一种色、香、味俱全的保健醋[8]，生产工艺和传统老陈醋加工工艺相似[9-10]。苦荞醋中富含氨基酸和微量元素[11]，在软化血管、降血脂、降血糖、调节机体代谢平衡方面具有明显的生物活性[12]。

苦荞富含膳食纤维，膳食纤维具有很高的持水性和膨胀力[13]，食用之后能产生明显饱腹感[14]；此外，膳食纤维具有较好的持油力[15]和降低胆固醇的功效，被广泛应用于食品加工工业中[16]。

黑曲霉常用于食品生产和发酵，在国际上被广泛使用[17]，经过发酵之后会产生纤维素酶、植酸酶和果胶酶等。本研究基于此，利用黑曲霉发酵技术，加工制备发酵型苦荞膳食纤维，并通过宏基因技术对比发酵前后苦荞膳食纤维对高脂饮食小鼠肠道中微生物群落的影响，为苦荞产业的发展提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

苦荞、黑曲霉、葡萄糖、胆固醇、胆酸钠、乙醇、α-淀粉酶、氯化钙、蛋白胨、硫酸亚铁、硫酸亚镁、琼脂、氯化钠、无水乙醇、RNA引物、酵母粉等。

1.2 试验仪器

水浴锅、粉碎机、灭菌锅、蒸发仪、电子显微镜、分析仪、红外光谱仪、超净工作台、离心机、分光光度计、PCR仪、纯水仪。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的制作

斜面培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂18 g，水1 mL，自然pH。

马铃薯培养基：葡萄糖10 g，马铃薯粉43 g，硫酸镁2 g，水1 mL，自然pH。

将上述的培养基制作完成之后，在121 ℃条件下灭菌15 min。

1.3.2 苦荞膳食纤维持水力的测定

苦荞膳食纤维持水力的测定参考文献[18]的方法进行。

1.3.3 苦荞膳食纤维持油力的测定

苦荞膳食纤维持油力的测定参考文献[19]的方法进行。

1.3.4 苦荞膳食纤维膨胀力的测定

苦荞膳食纤维膨胀力的测定参考文献[20]的方法进行；称取2 g苦荞膳食纤维，添加去离子水40 mL，摇匀之后静置。

膨胀力=V1－V2M。

式中：V1表示样品的初始体积，mL；V2表示静置之后的膨胀体积，mL；M表示加入样品的体积，mL。

1.3.5 小鼠肠道中微生物PCR扩增和测序

每个小鼠随机取3份样品，对每个样品进行DNA提取、PCR扩增，再通过电泳技术检测，最后将PCR结果送至测序公司进行高通量分析。

2 结果与讨论

2.1 苦荞膳食纤维制备及理化性质的分析

2.1.1 发酵前后苦荞膳食纤维中基本成分分析

通过对比发酵前后苦荞膳食纤维中的营养成分，发现采用黑曲霉发酵前后苦荞中灰分、蛋白质和脂肪的含量基本一致。由表1可知，苦荞中的膳食纤维包括不可溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维，发酵前苦荞膳食纤维中不可溶膳食纤维含量为（17.67±1.2）%，可溶性膳食纤维含量为（3.21±0.6）%；发酵后苦荞膳食纤维中不可溶膳食纤维含量为（16.23±0.8）%，可溶性膳食纤维含量为（4.57±0.8）%。结果表明发酵后的苦荞膳食纤维中不可溶膳食纤维含量减少，而可溶性膳食纤维含量增加。

2.1.2 苦荞膳食纤维持水力、持油力和膨胀力的测定

由图1可知，随着时间的增加，发酵前后的苦荞膳食纤维持水力先上升后下降。发酵后苦荞膳食纤维持水力最高为3.5 mg/g，发酵前苦荞膳食纤维持水力最高为3.0 mg/g，发酵后苦荞膳食纤维持水力明显高于发酵前苦荞膳食纤维持水力，这是由于发酵后的苦荞膳食纤维结构更加疏松多孔，表面积增加，使得苦荞膳食纤维的吸水能力和保水作用更强。

膳食纤维的持油力是评价膳食纤维品质的重要标准，正常情况下，膳食纤维的持油能力越强，则表示对胆固醇的吸附能力越强，其降血脂和降血糖的作用更好。膳食纤维持油力与分子大小、表面特性和电荷总数有关。由图2可知，随着时间的增加，发酵后苦荞膳食纤维持油力先升高后降低；发酵前苦荞膳食纤维持油力先升高再趋于稳定最终呈现下降的趋势。经过发酵后的苦荞膳食纤维持油力相比于发酵前的苦荞膳食纤维持油力更强，说明发酵后的膳食纤维更加疏松多孔，持油力也有所增加。

苦荞膳食纤维的膨胀力和其分子大小、表面特征和化学成分密切相关，更大的表面积和更小的粒径使得苦荞膳食纤维的膨胀力更高。此外，苦荞膳食纤维的提取温度、pH值和粉碎程度对膳食纤维的吸水膨胀力也会产生影响。由图3可知，经过发酵后的苦荞膳食纤维膨胀力有所增加，当时间为2 h时，苦荞膳食纤维的膨胀力从3.5 mL/g上升到4.2 mL/g，發酵后的苦荞膳食纤维膨胀力更高，这为发酵后的苦荞膳食纤维在食品中运用提供了指导和理论依据。

2.2 苦荞膳食纤维对高脂饮食小鼠肠道中微生物群落的影响

2.2.1 Alpha 多样性分析

人体和动物的肠道中存在各种各样的微生物，肠道微生物与人体长期共存，先前的研究结果表明，膳食纤维可以改良人体中的微生物种类和数量，从而对人体健康产生影响。

随着高通量技术的发展，测序的准确性和灵敏度也得到提高，通过对比饲喂发酵前苦荞膳食纤维、发酵后苦荞膳食纤维和未饲喂苦荞膳食纤维的高脂饮食小鼠肠道中微生物组成及变化，以研究经过黑曲霉发酵的苦荞膳食纤维对高脂饮食小鼠肠道微生物菌群的影响。

通过高通量技术对饲喂发酵前苦荞膳食纤维、发酵后苦荞膳食纤维和未饲喂膳食纤维（空白组）小鼠的肠道微生物多样性进行分析。

由图4可知，3个小组中共有微生物总数为100个，饲喂苦荞膳食纤维的小鼠肠道中独有的微生物总数为581个；饲喂未经过发酵苦荞膳食纤维的小鼠体内微生物总数为664个；未饲喂膳食纤维的小鼠体内微生物总数为1 345个，与未饲喂苦荞膳食纤维的小鼠相比，饲喂苦荞膳食纤维的小鼠体内微生物种类明显减少，说明食用一定量的膳食纤维，能够干预小鼠肠道中的微生物多样性和丰富性。

2.2.2 苦荞膳食纤维对高脂饮食小鼠肠道中微生物Beta多样性分析

采用聚类分析每3个样品之间微生物的相似性，试验结果表明，每3个样品出现明显的聚集，小鼠体内的微生物多样性相似度较高，3个不同的小组说明微生物群落之间有着一定程度差异，见图5。不同处理方式使得小鼠肠道中的微生物群落结构不同，见图6。

2.2.3 微生物群落门水平的差异分析

采用16S rRNA对小鼠肠道中的微生物门水平进行分析，由图7可知，不同的样本微生物的多样性不同。饲喂苦荞膳食纤维（A）的小鼠肠道中厚壁菌门含量最高，占总微生物数的71.23%，其次是拟杆菌门，含量为18.89%；饲喂经过发酵后的苦蕎膳食纤维，小鼠肠道中的后壁菌门含量降低，为54.25%，而拟杆菌门含量增加，为31.23%；未饲喂苦荞膳食纤维的小鼠肠道中的微生物种类上下波动幅度较大。结果表明，发酵型苦荞膳食纤维调节肠道微生物稳定能力强于未发酵苦荞膳食纤维。

2.2.4 微生物群落属水平的差异分析

从微生物属水平对小鼠肠道中微生物组成进行分析，3个小组中的乳酸杆菌（Lactobacillus）含量差异明显，见图8。饲喂未发酵的苦荞膳食纤维（A）和饲喂发酵型苦荞膳食纤维（B）的小鼠肠道中的乳酸菌含量低于未饲喂苦荞膳食纤维（C）的小鼠。饲喂发酵型苦荞膳食纤维的小鼠肠道中的乳酸杆菌含量为7.52%，饲喂未发酵的苦荞膳食纤维小鼠肠道中的乳酸菌含量为4.56%，未饲喂苦荞膳食纤维的小鼠肠道中的乳酸菌含量为2.13%，说明发酵型苦荞膳食纤维能够增加小鼠肠道中的乳酸菌含量且能改善肠道中微生物群落结构。

3 小结

发酵后苦荞膳食纤维中的蛋白质、水分和脂质含量基本保持不变。膳食纤维总含量也基本保持不变，但苦荞膳食纤维中的不可溶膳食纤维减少，可溶性膳食纤维增加。发酵后的苦荞膳食纤维持水力、持油力和膨胀力均得到了提高，调节高脂饮食小鼠肠道中微生物能力得到了增强，另外，经过发酵后的苦荞膳食纤维中的生物活性成分也得到了明显提高，这为发酵型苦荞膳食纤维的功能应用提供了理论基础。

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