小米发酵液菌种优化及作为豆腐凝固剂的应用研究

毕晟赟 曲艳 李玉娥 陈振家

摘要：为研究不同菌种小米发酵液对豆腐凝固特性和品质的影响，采用混合菌种、泡菜菌、鼠李糖乳杆菌、酵素菌制备小米发酵液，分析不同菌种对小米发酵液组成成分的影响以及不同小米发酵液对豆腐凝固性的影响。结果表明，12 d后鼠李糖乳杆菌小米发酵液产酸量达到7 g/L；发酵第2天时，泡菜菌的pH最先下降至3.375；鼠李糖乳杆菌的可溶性固形物含量在第10天最先降至1.4%；鼠李糖乳杆菌在发酵第12天时蛋白沉淀量为35 mg/mL；鼠李糖乳杆菌在发酵第12天时沉淀率达到35%。不同菌种小米发酵液对豆腐凝固特性和品质的影响不同，泡菜菌组制得的豆腐的品质最佳；泡菜菌组制得的豆腐的含水量约为78%，持水率为64%，得率为140%；泡菜菌组制得的豆腐的蛋白质含量为15%。该研究旨在为豆腐酸性凝固剂和小米产品的开发提供理论依据。

关键词：小米；发酵；豆腐；酸性凝固剂；凝固特性

中图分类号：TS214.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0012-06

Optimization of Millet Fermentation Broth Strains and Their Application as Tofu Coagulants

BI Sheng-yun， QU Yan， LI Yu-e， CHEN Zhen-jia*

（College of Food Science and Engineering， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801， China）

Abstract： In order to study the effects of different strains of millet fermentation broth on the coagulating properties and quality of tofu， millet fermentation broth is prepared by mixed strains， pickle bacteria， Lactobacillus rhamnosus and enzyme bacteria. The effects of different strains on the composition of millet fermentation broth and the effects of different millet fermentation broth on the coagulating properties of tofu are analyzed. The results show that the acid yield of Lactobacillus rhamnosus millet fermentation broth reaches 7 g/L after 12 days; on the 2nd day of fermentation， the pH of pickle bacteria decreases to 3.375 firstly; on the 10th day of fermentation， the soluble solid content of Lactobacillus rhamnosus decreases to 1.4% firstly; on the 12th day of fermentation， the protein precipitation amount of Lactobacillus rhamnosus is 35 mg/mL; on the 12th day of fermentation， the precipitation rate of Lactobacillus rhamnosus reaches 35%. Different strains of millet fermented broth have different effects on the coagulating properties and quality of tofu， and the quality of tofu prepared by pickle bacteria group is the best; the water content， water retention rate and yield of tofu prepared by pickle bacteria are about 78%， 64% and 140% respectively; the protein content of tofu prepared by pickle bacteria group is 15%. The purpose of this study is to provide theoretical basis for the development of tofu acid coagulant and millet products.

Key words： millet; fermentation; tofu; acid coagulant; coagulating properties

收稿日期：2023-01-16

基金項目：山西省重点研发计划项目（201903D221035）；山西农业大学博士科研启动项目（2016ZZ06）

作者简介：毕晟赟（2000—），男，硕士，研究方向：植物蛋白。

通信作者：陈振家（1981—），男，副教授，博士，研究方向：植物蛋白提取分离及修饰改性。

豆腐的起源可以追溯到2 000多年前的西汉[1]。作为蛋白的最佳来源之一，豆腐富含有益的脂质、维生素、矿物质以及其他生物活性物质。经过加热等工序，胰蛋白酶抑制剂、细胞凝集素等有害成分被有效除去，豆腐的利用率提高，蛋白更易被消化吸收[2]。研究发现豆腐能够降低患心血管疾病、糖尿病、高血脂癥等的风险[3]。在豆腐生产流程中，点浆是最关键的一步，通过添加凝固剂使得蛋白沉淀[4-5]。豆腐凝固剂通常归类为盐类、酶类和酸类三类。目前以CaSO4和MgCl2为主要的盐类凝固剂，石膏豆腐口感光滑，但硬度较低，盐卤豆腐有豆香味，但水分含量、得率较低。常见的酶类凝固剂有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、转谷氨酰胺酶，虽然有蛋白消化率高和豆腐细腻光滑的优点，但也有生产成本高和凝固时间长的问题。目前酸性凝固剂常用到的是葡萄糖酸内酯（GDL）。通过豆浆蛋白的热变性，使蛋白质内部的疏水基团暴露出来，凝固剂的加入使得豆乳体系的pH值下降，释放出的H+会中和蛋白质表面的负电荷，导致蛋白质分子间的静电斥力减弱，同时增强了疏水作用和二硫键等分子间的作用力，在这些化学键的共同作用下，蛋白质分子聚集形成凝胶网络结构。

小米的营养价值高，营养素比例适宜，有预防癌症和心血管疾病的优点[6]。小米经过发酵，能够降低单宁以及其他抗营养成分，提高蛋白质的消化率[7]。小米发酵液能有效地起到预防肠胃问题、降低胆固醇、减少炎症的作用[8]。用小米发酵液作为酸性凝固剂能够将原料蛋白分子转移至豆腐中，完善豆腐的蛋白类型，提高营养价值，但目前相关研究较少。为此进行不同菌种发酵小米浆的酸性凝固剂和添加小米发酵液制取豆腐的实验，为小米发酵和酸性凝固剂的开发提供一定数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米：晋谷21号；黄豆：市售；市售豆腐A（凝固剂：硫酸钙、氯化镁）：产于晋中市康晋食品有限公司；市售豆腐B（凝固剂：氯化镁）：产于山西绿源亨通农业科技股份有限公司；泡菜酸菜乳酸菌发酵粉、乳酸菌酸奶发酵粉、益生菌果蔬酵素发酵粉：北京川秀科技有限公司；混合菌（含保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌）、鼠李糖乳杆菌：山西农业大学乳品制品加工实验室。

氢氧化钠：天津市致远化学试剂有限公司；尿素：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸：成都市科隆化学品有限公司；酚酞：福晨（天津）化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、溴酚蓝、氢氧化钾、甘油。

1.2 仪器

实验仪器与设备见表1。

1.3 方法

1.3.1 小米发酵液的制备

小米的处理方法按照穆醒倩[9]的方法，略微修改。

浸泡：小米在足量的水中浸泡过夜；

糊化：浸泡过的小米按照1∶20的料水比在加热器中煮沸10 min；

胶磨匀浆：煮沸后的小米冷却至室温，搅拌均匀后倒入胶体磨中，每次胶磨1 min，共3次；

冷却：冷却至室温；

灭菌：将糊化的小米浆分装于锥形瓶中，高温灭菌并冷却至室温；

接菌发酵：按照相同的比例将菌种接入到小米液中，在34～36 ℃下进行发酵；

离心：将发酵好的样品在3 500 r/min下离心15 min，所得产品上清液即为以小米为原料的酸性凝固剂；

成品：制得成品。

1.3.2 豆浆的制备

干黄豆浸泡过夜，按照1∶5的料水比进行磨浆，利用适当的滤布进行过滤后，调整生豆浆的固形物含量到7.0%左右。将豆浆在电磁炉上煮沸，加入消泡剂，保持沸腾状态3～5 min，放置备用。

1.3.3 豆腐的制作

选择对应的发酵液，取豆浆体积的30%作为凝固剂，分两次加入到煮沸的豆浆中，蹲脑15 min后在豆腐模具中以相同压力压制30 min。

1.3.4 小米发酵液理化性质的测定

1.3.4.1 酸度的测定

取发酵0，2，4，6，8，10，12，14 d的不同种发酵液，按照GB 12456－2021[10]中酸碱指示剂滴定法测定，按下式计算总酸产量：

X=c×（V1-V2）×k×Fm×1 000。

式中：X为试样中总酸的含量（g/kg或g/L）；c为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度（mol/L）；k为酸的换算系数，其中苹果酸0.067，乙酸0.060，酒石酸0.075，柠檬酸0.064，柠檬酸（含一分子结晶水）0.070，乳酸0.090，盐酸0.036，硫酸0.049，磷酸0.049；F为试液的稀释倍数；V1为滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（mL）；V2为空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（mL）；m为试样的质量（g）或吸取试样的体积（mL）；1 000为换算系数。

1.3.4.2 pH的测定

以pH计法测定：取对应天数的发酵液进行测定，多次重复测定，取平均值。

1.3.4.3 可溶性固形物含量的测定

按照NY/T 2637－2014[11]中可溶性固形物测定方法，取对应天数的发酵液进行测定，重复测定3次，取平均值。

1.3.5 小米发酵液诱导蛋白沉淀量的测定

1.3.5.1 豆浆在不同发酵液影响下蛋白质沉淀量的测定

按王睿粲[12]的方法进行更改，取40 mL 85 ℃豆浆于离心管中，按照25%的比例分别加入发酵2，4，6，8，10，12，14 d的不同菌种所制发酵液，迅速振荡混匀后在85 ℃下静置15 min，以4 000 r/min离心30 min，采用考马斯亮蓝法测定加入发酵液后各上清液中可溶性蛋白含量（mg/mL）。

1.3.5.2 豆浆在不同发酵液影响下蛋白质沉淀率的测定

按照1.3.5.1的离心处理后，弃去上清液，倒置10 min，称量离心管与沉淀的重量，并按照下式进行计算：

X=m2-m0m1×100%。

式中：X为蛋白质沉淀率，%；m0为空白离心管的质量，g；m1为豆浆与离心管的质量，g；m2为沉淀物与离心管的质量，g。

1.3.6 小米发酵液所制豆腐品质的测定

1.3.6.1 豆腐质构（TPA）的测定[13]

将豆腐切成2 cm×2 cm×1 cm的方块，放在载物台上，将P/0.5探头对准中心位置，测定酸浆豆腐的凝胶强度，测定参数：检测速度60 mm/s，测后速度200 mm/s，起点感应力0.4 N，应变40%；压缩次数为2次，两次压缩的时间间隔为3 s。

1.3.6.2 豆腐色差的测定

豆腐的色泽使用全自动色差计测定（以L*、a*、b*值表示），先用白板进行校准，再对豆腐块进行测定。其中L*值代表亮度或白度；a*值代表红色或绿色；b*代表黄色或蓝色。

1.3.6.3 豆腐得率的测定

按照Cai等[14]的方法进行实验，将制得的鲜豆腐在室温下静置5 min后，精确称量，计算出每100 g黄豆所得鲜豆腐的质量。

1.3.6.4 豆腐水分含量的测定

按照GB 5009.3－2016[15]中的直接干燥法进行测定：取2 g豆腐（精确至0.000 1 g）于铝盒中，盒盖斜支于铝盒旁，置于101～105 ℃干燥箱中加热2～4 h，取出盖好，置于干燥器中冷却0.5 h，称量，重复干燥操作至恒重，按照下式进行计算：

X=m2-m3m1×100%。

式中：X为试样中水分的含量，%；m1为铝盒和试样的质量，g；m2为铝盒和试样干燥后的质量，g；m3为铝盒的质量，g。

1.3.6.5 豆腐持水率的测定[16]

称取约2 g新鲜豆腐，记录质量为W1，将其置于底部有脱脂棉的50 mL离心管中，以3 000 r/min的转速离心10 min后并称重，豆腐持水率按下式计算：

X=W2-W0W1×100%。

式中：X为试样的持水率，%；W0为空白离心管的质量，g；W1为称量豆腐的质量，g；W2为离心后豆腐与离心管的质量，g。

1.3.6.6 豆腐蛋白质含量的测定

按照GB 5009.5－2016[17]中的凯氏定氮法进行测定。

试样处理：称取0.5 g豆腐冻干粉（精确至0.001 g），移入定氮管中，加入0.4 g硫酸铜、6 g硫酸钾、20 mL硫酸及少量玻璃珠，瓶口放一小漏斗，置于消化炉中，完全碳化后，加强火力保持管内液体微沸，至管内液体呈澄清透明蓝绿色，继续加热0.5～1 h，放冷后定容至100 mL容量瓶中，同时做空白实验。

测定：保持水蒸气发生装置中水呈酸性且微沸状态，接收瓶中加入10 mL硼酸溶液及1～2滴指示剂。吸取5 mL试样处理液，接收瓶于液面下接收10 min后，离开液面继续1 min，立即滴定，并按照下式进行计算：

X=（V1-V2）×c×0.014 0m×V3/100×6.25×100%。

式中：X为试样中蛋白质的含量，g/100 g；V1为试样消耗硫酸标准滴定液的体积，mL；V2为试剂空白消耗硫酸标准滴定液的体积，mL；c为硫酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.014 0为1.0 mL硫酸标准滴定液相当的氮的质量，g；m为试样的质量，g；V3为吸取消化液的体积，mL；6.25为氮换算蛋白质的系数；100为换算系数。

1.3.7 数据统计与分析

本实验所有数据均是测定3次以上的平均值。使用SPSS 18.0中的单因素ANOVA和Duncan检验进行统计分析，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同菌种小米发酵液理化性质对比

2.1.1 不同菌种小米发酵液酸度的变化

泡菜菌、乳酸菌、酵素菌均为市售直投剂。混合菌由多种类型菌复配而得，具体菌种类型：泡菜酸菜乳酸菌发酵粉含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌；乳酸菌酸奶发酵粉含保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌；益生菌果蔬酵素发酵粉含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌。产酸较高的单一菌种鼠李糖乳杆菌为对照组，确定直投剂与其的差别。

由图1可知，5种菌种在发酵周期内均总体呈现前期快速上升，4 d后缓慢上升最终保持不变的趋势。其中鼠李糖乳杆菌小米发酵液产酸量最高，12 d后产酸量可达到7 g/L左右；泡菜菌与乳酸菌产酸程度大致相同，在发酵10 d时均可达6 g/L左右。这3种菌产酸量及生长能力较强；而混合菌与酵素菌产酸量较低，在14 d的发酵周期内最高产酸量不足5 g/L。

研究发现小米膳食纤维的单糖中含量最多的为木糖[18]；鼠李糖乳杆菌除能够利用小米中的单糖，在木糖为碳源的情况下生长，优于其他菌种[19]。由此可见，在小米酸性凝固剂的发酵中，鼠李糖乳杆菌利用小米中糖类的能力更优。对贵州苗族发酵性酸汤乳酸菌进行鉴定[20]可以发现通过嗜酸乳杆菌在以谷物为原料的情况下生长速度快，产酸能力高，而发酵時蛋白肽段的存在也能促使嗜酸乳杆菌的产酸和生长[21]，这使得嗜酸乳杆菌在小米发酵液的发酵过程中占优势地位。对小米自然发酵菌株进行研究发现，植物乳杆菌虽有产酒石酸及乳酸的能力，但无分解淀粉的能力[22]。综上说明含有优势菌种的鼠李糖乳杆菌、泡菜菌和乳酸菌在发酵小米浆时产酸能力较高。

2.1.2 不同菌种小米发酵液pH的变化

发酵时pH值的变化是评价产酸菌群在小米浆中发酵程度的另一个重要指标，快速下降的pH能保证发酵体系不被污染，创造适宜生长的环境；同时，产酸菌的大量繁殖可以抑制杂菌的生长，也能防止发酵体系的污染。

由图2可知，在14 d的发酵周期内，5种菌种的pH值随着发酵时间的增加呈现先快速降低，在8 d后基本保持不变的状态。其中，鼠李糖乳杆菌与泡菜菌下降速度最快，且pH值相对较低，在发酵8 d时，pH值达到3.0左右。相比之下，混合菌和酵素菌的pH值变化程度小，在发酵过程中最低pH值均在3.3左右。发酵0～2 d处于发酵前期，泡菜菌的pH下降速度最快，乳酸菌和鼠李糖乳杆菌次之，说明小米浆的产酸速率与菌种类型有关。

2.1.3 不同菌种小米发酵液可溶性固形物的变化

5种菌种在发酵过程中可溶性固形物的变化情况见图3。

由图3可知，从整个发酵过程来看，可溶性固形物含量呈现上升与下降混杂的趋势，但整体表现为下降；造成这种现象的原因可能是小米中原本不可溶的成分随着发酵的进行逐渐分解成可溶的小分子成分，同时菌种不断利用小米液中原有的糖类物质。

在所有菌种中，鼠李糖乳杆菌的下降速度最快，且在发酵10 d时固形物含量达到1.4%左右，泡菜菌与乳酸菌的下降程度略低于鼠李糖乳杆菌。综上所述，在小米浆发酵过程中，鼠李糖乳杆菌利用碳源的能力最高。

2.2 不同菌种小米发酵液蛋白沉淀量的测定

2.2.1 不同发酵液影响下蛋白质沉淀量的测定

由图4可知，鼠李糖乳杆菌、泡菜菌、乳酸菌发酵液的蛋白质沉淀量均随着发酵时间的增加呈现先升高后降低的趋势，发酵8～12 d各种发酵液的蛋白质沉淀量较高，这与不同菌种的酸度随时间变化的情况相符合，说明蛋白质沉淀量在一定程度上与发酵液的酸度相关。在5种菌种中，鼠李糖乳杆菌发酵液在发酵12 d时蛋白沉淀量最高，利用蛋白质的能力最强，沉淀量在35 mg/mL左右；发酵8～10 d时泡菜菌发酵液与乳酸菌发酵液的酸度相近，但其沉淀量高于乳酸菌发酵液，为30 mg/mL左右。造成这种现象的原因可能是不同发酵液中有机酸的种类及含量不同，不同阴离子之间H+电离速率不同，豆浆对其敏感程度有所差异，导致酸度相近的发酵液所得到的蛋白沉淀量也有所差别[23]。

2.2.2 不同发酵液影响下蛋白质沉淀率的测定

豆浆在发酵液诱导下形成的沉淀包括蛋白质、脂质等多种成分，在一定程度上更符合豆腐的组成。由图5可知，鼠李糖乳杆菌、泡菜菌、乳酸菌的蛋白沉淀率高于混合菌和酵素菌，鼠李糖乳杆菌在发酵12 d时沉淀率达到最大，在35%左右；泡菜菌在发酵10 d左右沉淀率达到30%左右。其余3种菌在发酵10 d时沉淀率保持在20%左右，酵素菌发酵液的沉淀率约为15%，混合菌和乳酸菌发酵液的沉淀率也未随发酵时间的延长而改变，这与图4的变化情况相同。

2.3 小米发酵液所制豆腐品质的评价

2.3.1 豆腐质构的测定

质构分析仪可以模拟口腔咀嚼并客观反映豆腐样品的质构特征。从TPA曲线中可获得硬度、弹性、内聚性、咀嚼性等。硬度是探头在第一次压缩过程中感受到的最大力；弹性是在去除外力后样品恢复到原始状态的能力；内聚性用第二次压缩面积与第一次压缩面积的比值表示；咀嚼性为将食物咀嚼成可吞咽状态所需的能量。弹性与咀嚼性密切相关，弹性值越高，咀嚼时需要的能量越高。

由表2可知，在5种不同发酵液所制成的豆腐中，泡菜菌发酵小米液所制豆腐在硬度和咀嚼性上与其他菌种所制豆腐存在显著差异（P<0.05），而在内聚性和弹性上泡菜菌与乳酸菌所制豆腐无显著差异（P>0.05），泡菜菌所制豆腐的质地相对更坚硬。研究发现凝乳的硬度与其交联程度有关，凝胶网络越致密，空隙越小，凝胶破裂需要的力越大，并且持水率也越高，这与豆腐持水率的变化趋势基本相同[24]。凝胶的内聚性较强，其内部结构更强，在反复变形时更好地粘在一起[25]。同市售豆腐相比，泡菜菌与乳酸菌所得发酵液制成的豆腐质构差别不大，甚至略优于市售豆腐，说明其达到制作标准。

总体来看，加入泡菜菌小米发酵液所制得的豆腐内部结构更紧密，更适宜用于豆腐酸性凝固剂的生产，所得豆腐与市售豆腐差别不大。

2.3.2 豆腐色差测定

由表3可知，不同菌种小米发酵液所制得的豆腐，乳酸菌发酵液在L*、b*值上同其余豆腐相比较高，有显著差异（P<0.05）；在a*值上，泡菜菌与乳酸菌发酵液所制得的豆腐较其他3种较高，而酵素菌所制得的豆腐a*值显著降低。这可能是因为利用乳酸菌发酵的小米液加工豆腐时，会有更多的含色素物质进入到豆腐中，促使豆腐的颜色加深；而酵素菌发酵所制得的小米液可能因为发酵时产生的色素含量较低或参与豆腐凝胶形成的能力较低，导致所制得的豆腐的颜色较浅。

同市售豆腐相比，利用小米发酵液制成的豆腐L*值均较高，除酵素菌发酵液所得豆腐外，其余发酵液制得的豆腐的a*值差别不大，这进一步说明小米发酵液制作豆腐时一部分小米色素将参与豆腐组成。

2.3.3 豆腐水分含量、持水率和得率的影响

由图6可知，5种发酵液所制成的豆腐水分含量均在76%～78%左右。其中乳酸菌所制发酵液制作的豆腐含水量最低，为76%；而酵素菌所制的豆腐含水量为78%，其余3种无显著差异（P>0.05）。不同菌种所得小米发酵液凝固剂制备的豆腐之间持水率无显著差异，相较而言，泡菜菌与乳酸菌所制的豆腐持水率相对较高，为64%，另外3种相对较低。豆腐得率之间有差异，其中泡菜菌、乳酸菌和酵素菌小米发酵液所制的豆腐得率較高，有显著差异（P<0.05）。在豆腐的凝胶系统中，水与蛋白分子缔合，或保持在凝胶网络的孔中。凝固剂的引入使得大分子链因静电力和疏水相互作用聚集，然后通过二硫键、氢键、离子键等其他分子力连接，初步形成网络结构，增加了持水率。较强的持水率说明凝固剂效果更佳。

结果证明泡菜菌及乳酸菌制得的小米发酵液在豆腐的制作时效果更好，可能是因为这两种菌发酵所得的小米液中有机酸含量更适宜酸浆豆腐的制作。不同类型的有机酸诱导形成的豆腐凝胶在机械学结构、微观结构上均有差异，改变有机酸类型及其添加量可制成不同类型的豆腐[26]。

2.3.4 豆腐蛋白质含量的影响

豆腐由变性大豆蛋白质通过添加凝胶剂制得，因此豆腐的蛋白质含量是影响豆腐品质的重要因素，也是反映豆腐营养价值的重要指标。由图7可知，不同菌种发酵而成的小米发酵液点制的豆腐蛋白质含量的差异显著（P<0.05）。其中，泡菜菌发酵制得的豆腐蛋白质含量最高，为15%；鼠李糖乳杆菌发酵制得的豆腐蛋白质含量最低，为11%。蛋白质含量的差异与豆腐的出品率和持水率变化相一致，再次说明泡菜菌发酵所得小米发酵液聚集蛋白质的能力较强，形成的蛋白凝胶结构也更紧密。

3 结论

以混合菌、泡菜菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸菌、酵素菌作为发酵剂，测定小米发酵液的产酸量、pH值、可溶性固形物含量，测定蛋白沉淀率、沉淀量以确定诱导沉淀能力，对不同菌种小米发酵液制得的豆腐的品质特性进行分析测定。结果表明，泡菜菌组发酵小米浆过程中的pH变化最明显，鼠李糖乳杆菌组可溶性固形物含量变化最大，产酸量更大；鼠李糖乳杆菌发酵12 d后蛋白沉淀率最高。总体而言，在相同条件下，鼠李糖乳杆菌的产酸能力、凝固蛋白能力强，但泡菜菌所制豆腐的得率、持水率、蛋白质含量、质构特性更优。

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