云南黑松露脂肪酶酶学性质研究及应用

王琪 高厚基 瞿静 谢政泽 吴春霞 陈韬

摘要：為拓宽云南黑松露的应用范围，采用双水相萃取法、壳聚糖沉淀法和双水相-壳聚糖沉淀结合法对云南黑松露脂肪酶进行纯化，确定最佳纯化方法，并研究脂肪酶的酶学特性、酶动力学及在中式香肠中的应用。结果表明，双水相-壳聚糖沉淀结合法纯化效果最好，酶比活力达到最高42.98 U/mg。黑松露脂肪酶最适温度为50 ℃，最适pH值为5，Km=33.33 mol/L，Vmax=1.91 mol/（L·min）。将黑松露经过完全灭酶（CK组）和不灭酶（HT组）处理后添加在中式香肠中，HT组新增花生四烯酸、月桂酸、二十一烷酸，且4种饱和脂肪酸、4种单不饱和脂肪酸和3种多不饱和脂肪酸的含量显著提高（P＜0.05）。HT组的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总含量均约为CK组的2倍。综上，在中式香肠中添加云南黑松露，可以促进脂质水解，从而增加中式香肠中优质脂肪酸和风味前体物质的含量。

关键词：黑松露；脂肪酶；酶学特性；游离脂肪酸

中图分类号：TS201.25      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）08-0033-06

Study on Enzymatic Properties of Yunnan Tuber melanosporum Lipase and Its Application

WANG Qi1，2，3， GAO Hou-ji2， QU Jing1，4， XIE Zheng-ze1， WU Chun-xia1， CHEN Tao1*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，

China; 2.Kunming Gaoshanggao Food Co.， Ltd.， Kunming 650100， China; 3.School of

Wuliangye Technology and Food Engineering， Yibin Vocational and Technical College，

Yibin 644003， China; 4.Scientific and Technological Information Division， Chuxiong

Medical College， Chuxiong 675000， China）

Abstract： In order to broaden the application scope of Yunnan Tuber melanosporum， Yunnan Tuber melanosporum lipase is purified by aqueous two-phase extraction， chitosan precipitation and combination of aqueous two-phase extraction and chitosan precipitation to determine the best purification method. Meanwhile， the enzymatic properties， enzyme kinetics and application of lipase in Chinese sausages are studied. The results show that purification effect of the combination of aqueous two-phase extraction and chitosan precipitation is the best， with the highest enzyme specific activity of 42.98 U/mg. The optimum temperature of Tuber melanosporum lipase is 50 ℃， the optimum pH value is 5， Km=33.33 mol/L， and Vmax=1.91 mol/（L·min）. When Tuber melanosporum is added into Chinese sausages after complete inactivated enzyme （CK group） and non-inactivated enzyme （HT group）， arachidonic acid， lauric acid and heneicosan oic acid appear in HT group， and the content of four saturated fatty acids， four monounsaturated fatty acids and three polyunsaturated fatty acids increases significantly （P<0.05）. The total content of saturated， monounsaturated and polyunsaturated fatty acids in HT group is all about twice as much as that in CK group. In conclusion， it can be seen that the addition of Yunnan Tuber

melanosporum into Chinese sausages can promote lipolysis， thus increasing the content of high-quality fatty acids and flavor precursors in Chinese sausages.

Key words： Tuber melanosporum; lipase; enzymatic properties; free fatty acid

收稿日期：2023-02-19

基金项目：云南农业大学科研发展基金项目（KX900127000）；云南农业大学第十五届学生创新创业行动基金项目（2022ZKY349）

作者简介：王琪（1989－），女，副教授，博士研究生，研究方向：肉品质控制和畜产品加工。

通信作者：陈韬（1963－），男，教授，博士，研究方向：肉品质控制和畜产品加工。

黑松露（Tuber melanosporum），又称黑块菌，在我国山林地区俗称“猪拱菌”、“无娘藤”、“土菇”、“松毛茯苓”，是一类地下生子囊菌门真菌[1]，子囊果实以暗色为主，且表面有明显的瘤突，主要分布在云南、四川等西南地区，最近在北方地区也有发现[2-3]。云南黑松露资源丰富且营养价值高[4-6]，富含多糖[7]、α-雄烷醇（α-androstanol，即5α-雄甾-16-烯-3α-醇）[8]、鞘脂[9]、甾醇[10]等多种生物活性物质，具有提高免疫力、抗炎症、抗肿瘤等药用价值[11-14]。目前，国内学者对黑松露的研究主要集中在培育、生物活性物质的提取等方面，而对黑松露其他方面的研究与开发还远远不够。

中式香肠是深受人们喜爱的传统特色肉制品。目前中式香肠加工中主要采用烘烤方式进行干燥，因为加工时间短，所以风味欠佳。因此，企业在生产中通过添加少量的黑松露来改善香肠的风味，但是黑松露能改善中式香肠风味的原因并不清楚。Martin等[15]研究表明黑松露中含有较多编码脂肪酶的基因，Wu等[16]的研究也表明黑松露提取物可以使糖尿病小鼠的脂肪酶含量提高，从而促进脂质的代谢，說明黑松露中富含脂肪酶。脂肪酶（lipase），又称三酰基甘油三酯酰水解酶，是一类在亲水亲脂界面分解和合成甘油三酯的酶，是一种重要的生物和工业用酶，广泛应用于食品加工[17-18]、油脂加工[19]、化妆品、制药[20]等行业。脂质是肉制品的主要成分之一，在肉类加工中脂质在脂肪酶和磷脂酶的作用下会产生游离脂肪酸，游离脂肪酸进一步氧化产生醛类、酮类、酯类等风味物质[21-22]。

因此，我们推测，添加了黑松露的中式香肠，其风味改善可能与香肠中脂类水解有关。而关于云南黑松露脂肪酶的相关研究鲜见报道。所以，本文对云南黑松露中的脂肪酶进行提取、纯化，研究黑松露脂肪酶的酶学特性及其对中式香肠脂类的水解情况，探究黑松露改善中式香肠风味的原因，并为黑松露在食品中的应用和开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜肉、香辛料等：购于昆明市本地超市；干制黑松露（采自香格里拉）：由昆明市高上高食品有限公司提供；聚乙二醇2000（PEG2000）：天津百伦斯生物技术有限公司；油酸、三油酸甘油酯：上海源叶生物科技有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司；异丙醇（99.7%）：天津市风船化学试剂科技有限公司；正己烷、异丙醇、甲醇（色谱纯）：CNW公司；D35-氘代硬脂酸（内标物98%）：Sigma有限公司；所有分离用的有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T25-Basc高速匀浆机 德国IKA公司；HC-3018高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司；U-2910紫外分光光度计 日本日立公司；HI9024 pH计 意大利HANNA仪器公司；ZGDCY-24氮吹仪 上海梓桂仪器有限公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 中式香肠的制作

将原料肉切丁（大小约1 cm3），加入辅料拌匀，腌制2 h，装入人造肠衣，扎孔排气后放入52 ℃烘箱中烘烤24 h，冷却，真空包装，备用。中式香肠配方：原料肉500 g（肥瘦比3∶7），白砂糖40 g，食盐10 g，味精10 g，饮用水40 g，高度白酒15 g，D-异抗坏血酸钠60 g，亚硝酸钠9 g。

1.3.2 黑松露脂肪酶的提取和纯化

1.3.2.1 黑松露脂肪酶的提取

取适量黑松露，用预冷的4 ℃蒸馏水清洗，再用滤纸吸干，称重5.00 g，剪碎，加入50 mL 4 ℃蒸馏水，用高速组织捣碎机捣碎2 min，再用离心机以4 000 r/min 的速度离心20 min，离心后取上清液即为粗酶液[23-24]。

1.3.2.2 黑松露脂肪酶的纯化

双水相萃取法：参照母应春等[25]的方法，并做适当修改。采用PEG2000/硫酸铵双水相萃取体系，将4 mL PEG2000溶液、4 mL硫酸铵溶液、2 mL粗酶液在常温下混合后静置15 min分相[11]，取双水相体系的上相即为脂肪酶纯化酶液。

壳聚糖沉淀法：取4 mL粗酶液，加入2 mL壳聚糖醋酸溶液，混合后调pH至6.5，搅拌均匀后以5 000 r/min离心20 min，弃去上清液，得到壳聚糖-脂肪酶复合物，复合物溶于4 mL且pH为3.8的醋酸盐缓冲液中，剧烈搅拌30 min，使壳聚糖-脂肪酶复合物解离，以5 000 r/min离心20 min，进一步去除体系中少量的仍与脂肪酶结合的壳聚糖和体系中的盐类及杂质，上清液即为脂肪酶纯化酶液[26]。

双水相-壳聚糖结合法：简称结合法，将上述双水相萃取法提取的脂肪酶溶液再用壳聚糖沉淀法进行进一步的纯化，得到最终脂肪酶纯化酶液。

1.3.3 脂肪酶验证试验

将猪背膘切丁（0.3 cm3），称取10 g分别置于2支试管中，一支加入2 mL结合法纯化的脂肪酶酶液，另一支加入2 mL蒸馏水作为对照组，于50 ℃反应24 h后测定酸价。称取20 g样品，参照GB 5009.229－2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》中第一法指示剂滴定法进行测定，每个样品测定3次。

1.3.4 黑松露脂肪酶纯度和酶活力的测定

采用双水相萃取法、壳聚糖沉淀法、结合法对粗酶液进行纯化，对3个方法纯化后的脂肪酶比活力、蛋白质含量进行测定，确定黑松露脂肪酶的最佳纯化方法。

蛋白质含量的测定：参照徐亚等[27]的方法，采用考马斯亮蓝法测定脂肪酶酶液中的蛋白质含量。

黑松露脂肪酶酶活力的测定：参照王琪等[28]的方法，采用铜皂法测定脂肪酶比活力。

1.3.5 黑松露脂肪酶酶学特性的研究

将最佳方法纯化的酶液用于酶学性质研究。

1.3.5.1 温度对黑松露脂肪酶酶比活力的影响

每支试管中加入2 mL黑松露纯化的脂肪酶酶液，分别置于25，30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃的水浴中反应30 min后测定酶比活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活。

1.3.5.2 温度对黑松露脂肪酶稳定性的影响

分别取15 mL黑松露纯化的脂肪酶酶液置于40，50，60，70，80，90 ℃条件下孵育60 min，以最高酶活力为100%计算相对酶活。

1.3.5.3 pH对黑松露脂肪酶酶活力的影响

取黑松露脂肪酶酶液1 mL与pH分别为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以1∶1的体积比置于试管中，在50 ℃下反应15 min后测定酶比活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活。

1.3.5.4 pH对黑松露脂肪酶稳定性的影响

取黑松露脂肪酶酶液1 mL与pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以1∶1的体积比置于试管中，在4 ℃的环境下反应12 h，测定酶比活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活。

1.3.6 酶动力学试验

在最适反应条件（温度50 ℃、pH 5）下，设置不同底物浓度，测定脂肪酶酶比活力。以底物浓度（1/[S]）为横坐标、反应速率倒数（1/V）为纵坐标进行Lineweaver-Burk双倒数作图，根据拟合得到的直线与坐标轴交点位置，计算米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）[29]。

1V=KmVmax×1[S]+1Vmax。

式中：V为酶促反应速率；Vmax为最大反应速率；Km为米氏常数；[S]为底物浓度。

1.3.7 黑松露对中式香肠脂肪酸的影响

试验采用气相色谱-质谱联用法对不灭酶（黑松露不经过热处理添加到中式香肠中，简称HT组）和完全灭酶（黑松露经过90 ℃热处理60 min添加到中式香肠中，简称CK组）的香肠游离脂肪酸的组成及含量进行定性定量分析，游离脂肪酸的具体测定方法如下。

样品的预处理：取1 g剪碎混合均匀的香肠样品于20 mL离心管中，加入9.6 mL的提取液（异丙醇∶正己烷为2∶3），再加入40 μL的D35-氘代硬脂酸内标物（1 mg/L，溶于正己烷），涡旋振荡10 s，加入钢珠；用40 Hz研磨仪处理4 min后超声处理5 min（超声过程中需要保持冰水浴）；将处理后的样本置于4 ℃、12 000 r/min下离心15 min；离心后移取4 mL上清液于10 mL离心管中，氮气吹干。加入2 mL甲醇、1 mL三甲基硅烷基重氮甲烷，涡旋振荡10 s混匀，室温下静置15 min，再次用氮气吹干；加入1.6 mL正己烷复溶，以12 000 r/min离心5 min，取上清液于样品瓶中，进行GC-MS检测[30]。

GC-MS分析条件：进样量1 μL，分流比5∶1，隔垫吹扫流速3 mL/min，载气He，色谱柱DB-FastFAME（90 m×250 μm×0.25 μm），柱壓46 psi，柱箱升温程序为50 ℃保持1 min，以50 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持15 min，以2 ℃/min的速率升温至210 ℃，保持1 min，以10 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持16.5 min。前进样口温度240 ℃，传输线温度240 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离电压－70 eV，质量扫描范围（m/z）：33～400，扫描模式SIM，溶剂延迟7 min[31]。

C=Cs×V1×V2M×V3。

式中：C为样本中游离脂肪酸的含量，μg/g；Cs为复溶液游离脂肪酸的浓度，mg/L；V1为复溶体积，mL；V2为加入提取液的体积；V3为取出提取液的体积；M为样品质量，mg。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0和OriginPro 2018C软件进行数据分析与图形绘制，结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与讨论

2.1 黑松露脂肪酶的纯化

由图1中A和B可知，黑松露脂肪酶粗酶液的总蛋白含量为1.78 mg/mL，酶比活力为6.17 U/mg。分别采用双水相萃取法、壳聚糖沉淀法、结合法3种方法对脂肪酶粗酶液进行纯化，3种方法纯化后的酶液总蛋白质含量显著下降（P＜0.05），酶比活力显著提高（P＜0.05），说明黑松露脂肪酶粗酶液得到了进一步的提纯。其中，采用结合法纯化的效果最佳，酶比活力显著高于双水相萃取法和壳聚糖沉淀法（P＜0.05），酶比活力达到42.98 U/mg，与粗酶液相比，纯化倍数达到7.1倍。因此，本文采用结合法纯化的黑松露脂肪酶完成后续的相关研究。

用结合法纯化后的酶液对肥膘肉进行脂质降解测试，结果见图2。添加纯化酶液的试验组酸价显著高于对照组（P＜0.05），说明纯化后的脂肪酶酶液可以分解肥膘肉产生游离脂肪酸，从而提高酸价。

2.2 黑松露脂肪酶酶学性质

2.2.1 温度对黑松露脂肪酶酶活力的影响

脂肪酶的酶比活力作为一项重要指标来表征脂肪酶的催化能力[32]。由图3可知，随着处理温度的升高，黑松露脂肪酶的相对酶活逐渐上升，在50 ℃时达到最高，继续升温，相对酶活急剧下降。当温度在25～55 ℃时，相对酶活保持在50%以上，说明25～50 ℃对黑松露脂肪酶有一定的催化作用，超过50 ℃对相对酶活有一定的抑制作用。原因可能是在一定温度范围内，温度可以催化酶的活性中心，从而提高酶活力[33]。当温度超过一定范围时，高温会改变蛋白内部的二级结构，从而改变蛋白质空间构象，破坏蛋白质结构的稳定性，最终使酶丧失活性[34-35]。因此，黑松露脂肪酶的最适温度为50 ℃。

2.2.2 温度对黑松露脂肪酶稳定性的影响

黑松露脂肪酶在40～90 ℃孵育60 min后酶的稳定性见图4。

由图4可知，40 ℃时黑松露脂肪酶相对酶活为95.35%，50 ℃时相对酶活达到最高，继续升温，相对酶活显著下降（P＜0.05），在60 ℃时，相对酶活只有56.30%。在80 ℃时，相对酶活力基本趋近于0，说明黑松露脂肪酶在40～50 ℃时酶活力相对稳定。

2.2.3 pH对黑松露脂肪酶酶活力的影响

在50 ℃、pH 3.0～8.0的条件下测定脂肪酶的相对酶活，结果见图5。

由图5可知，随着pH的增加，黑松露脂肪酶的相对酶活显著升高（P＜0.05），pH为5时达到最高，pH＞5之后，酶活力显著下降（P＜0.05），pH＞7之后趋于平缓，相对酶活只有33%～34%。原因可能是酶分子有许多极性基团，这些基团在不同的pH下解离状态不同，在最适pH下才能与底物很好地结合，起到最大的催化作用[36]。因此，黑松露脂肪酶的最适pH为5.0。

2.2.4 pH对黑松露脂肪酶稳定性的影响

黑松露脂肪酶在4 ℃的环境下孵育12 h后不同pH下相对酶活见图6。

由图6可知，随着pH的增加，相对酶活显著升高（P＜0.05），pH为5时相对酶活最高。随着pH值的继续增加，相对酶活显著下降（P＜0.05），pH为7.5时，相对酶活不再显著下降（P＞0.05），但相对酶活只有42.10%。原因可能是不同的pH会影响酶与底物的结合。当pH改变不是很剧烈时，黑松露脂肪酶虽未变性，但是酶活力也有所降低。而pH过酸或过碱，会影响酶的活性部位使酶的空间结构改变，从而使酶失活[37]。pH为4～6时，相对酶活＞77%。因此，pH在4～6范围内较稳定。

2.3 酶动力学结果

纯化后的酶液在最适反应温度为50 ℃和pH为5的条件下，以不同浓度的橄榄油为底物，测定脂肪酶酶比活力，计算相应的反应速度。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，以底物浓度（1/[S]）为横坐标、反应速率倒数（1/V）为纵坐标，根据拟合得到的黑松露脂肪酶的线性方程为Km=33.33 mol/L，Vmax=1.91 mol/（L·min）。

2.4 黑松露对中式香肠脂肪酸的影响

中式香肠游离脂肪酸的种类及含量见表1和表2。

由表1和表2可知，CK组香肠共检出25种游离脂肪酸，其中饱和脂肪酸10种，单不饱和脂肪酸6种，多不饱和脂肪酸9种。HT组香肠共检出28种游离脂肪酸，其中饱和脂肪酸12种，单不饱和脂肪酸6种，多不饱和脂肪酸10种。HT组香肠的游离脂肪酸总含量显著高于CK组，约是CK组的1.8倍。HT组的3种脂肪酸总量均显著高于CK组（P＜0.05），且含量均约为CK组的2倍，CK组和HT组三大类脂肪酸的比例变化不大，分别为1∶2.06∶1.28和1∶2.03∶1.16。两组中单不饱和脂肪酸含量均最高，其次是多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸。

飽和脂肪酸中月桂酸和二十一烷酸只在HT组中检出，HT组的肉豆蔻酸、二十烷酸含量均显著高于CK组（P＜0.05），棕榈酸、硬脂酸含量均极显著高于CK组（P＜0.01）。单不饱和脂肪中HT组的棕榈油酸、油酸、十九碳烯酸含量极显著高于CK组（P＜0.01），二十碳烯酸含量显著高于CK组（P＜0.05），且油酸含量是CK组的1.75倍。多不饱和脂肪酸中HT组的亚油酸含量极显著高于CK组（P＜0.01），约为CK组的1.75倍。亚麻酸、二十碳二烯酸含量显著高于CK组（P＜0.05）。花生四烯酸只在HT组检出。

由此可知，添加未灭酶的黑松露到中式香肠中，可以提高游离脂肪酸的含量，尤其是优质脂肪酸，因此，黑松露的添加可以促进中式香肠风味前体物质的产生。

3 结论

采用双水相-壳聚糖结合法纯化黑松露脂肪酶的效果最好，酶比活力达到最高42.98 U/mg。黑松露脂肪酶的最适温度为50 ℃，在40～50 ℃范围内酶活力较稳定，最适pH值为5.0，pH在4～6范围内酶活力较稳定。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法拟合得到Km=33.33 mol/L，Vmax=1.91 mol/（L·min）。将黑松露经过灭酶和不灭酶处理后添加到中式香肠中，HT组中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总含量显著高于CK组（P＜0.05），且三大类脂肪酸的比例变化不大。单不饱和脂肪酸在两组中占比均最高，接近50%。与CK组相比，HT组新增月桂酸、二十一烷酸和花生四烯酸，4种饱和脂肪酸、4种单不饱和脂肪酸和3种多不饱和脂肪酸的含量显著提高（P＜0.05）。因此，在中式香肠中添加黑松露，可以促进脂质的水解，从而增加中式香肠的优质脂肪酸含量和促进风味前体物质的生成。

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