高效反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷条件和性能研究

袁野 周佳 屈建航 张博源 罗宇 李海峰

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450000）

随着食品工业的发展，食品加工废水已经成为污水处理的重要对象，如屠宰及肉类加工废水［1］、豆制品废水［2］、餐厨废水［3］、柠檬酸生产废水［4］等，该类废水的主要特征为高氮高磷、生化需氧量高、悬浮物多。其中氮和磷是引起水体富营养化的限制性因素［5］。

食品加工废水的处理多采用生物法以无氧/好氧阶段交替完成［6］，处理过程依赖于不同功能的微生物，如硝化细菌、反硝化细菌和聚磷生物（polyphosphate accumulating organisms，PAOs）的共同作用，往往需要额外添加碳源来提高氮和磷的去除效率，增加运行成本［7］。反硝化聚磷菌（denitrifying phosphate accumulating organisms，DPAOs）是一种具有独特代谢特性的反硝化细菌［8］，在消耗可用碳源时细胞产生并储存聚β-羟基丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB），当外部碳源耗尽时，PHB可作为碳源使用，而在缺氧条件下，细胞利用亚硝酸盐/硝酸盐作为电子受体积累磷酸盐［9］，从而减少氧气需求、污泥产生以及和不同功能菌间的碳源竞争，有效缓解废水处理工艺的压力，提升氮磷去除效果。

目前报道的反硝化聚磷菌，种类逐步多样化，如筛选自缺氧池中的陶厄氏菌（Thauera）［10］、好氧生物反应器活性污泥的大肠杆菌（Escherichia coli）［11］、驯化后活性污泥中的戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis）［12］、污染沉积物中的斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）［13］，以及产碱菌属（Alcaligenes）、肠杆菌属（Enterobacter）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）和芽胞杆菌属（Bacillus）等［14］。高效反硝化聚磷菌株的筛选是脱氮除磷深入研究和应用开发的菌物基础，但当前的菌种能力仍有非常大的提升和挖掘空间［15］。另一方面，反硝化聚磷菌应用于强化生物脱氮除磷，尤其是针对高氮高磷类废水，研究仍相对薄弱。

本研究拟从二沉池活性污泥中筛选出高效反硝化聚磷菌，通过单因素等实验确定其最佳工艺条件，并将其应用于不同类型食品模拟废水的处理，以期为实际废水的处理提供菌物参考和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 活性污泥样品取自河南省某污水处理厂二沉池，采用取样器收集泥水充分混合液，4℃带回实验室使用。

1.1.2 主要仪器与设备 恒温培养箱，博讯实业有限公司；SIGMA3-30K高速冷冻离心机，德国Sigma Laborzentrifugen公司；C1000 Touch PCR仪，美国Bio-Rad；721型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基［16］（g/L）：蛋白胨10.00，牛肉膏3.00，氯化钠5.00，pH 7.20。

R2A培养基［17］（g/L）：酵母浸出物0.50，胰蛋白胨0.50，酪氨酸0.50，葡萄糖0.50，可溶性淀粉0.50，K2HPO40.30，MgSO4·7H2O 0.05，丙酮酸钠0.30，琼脂15.00，pH 7.20-7.40。

1% BTB-反硝化培养基［14］（g/L）：乙酸钠 3.01，KNO32.00，MgSO4·7H2O 0.20，琼脂13.50，1%-BTB 4.00 mL，pH 7.20-7.40。

富氮富磷培养基［16］（g/L）：乙酸钠 3.32，MgSO4·7H2O 0.10，CaCl20.03，K2HPO40.06，NH4Cl 0.31，KNO30.29，NaCl 0.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

微量元素［16］（g/L）：乙二胺四乙酸二钠63.70，FeSO4·7H2O 5.00，CuSO4·5H2O 1.60，MnCl2·4H2O 5.10，CaCl25.50，ZnSO4·7H2O 2.20，钼酸钠1.10，CoCl2·6H2O 1.60，pH 7.20-7.40。

1.1.4 模拟废水 屠宰及肉类加工废水［1］（g/L）：乙酸钠 3.34，尿素0.05，K2HPO40.08，NH4Cl 0.38，KNO30.22，NaCl 0.07，CaCl20.05，MgSO4·7H2O 0.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

柠檬酸废水［4］（g/L）：乙酸钠1.28，NH4Cl 0.12，KNO30.15，K2HPO40.03，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

豆制品废水［2］（g/L）：乙酸钠 3.85，NH4Cl 0.38，KNO30.36，K2HPO40.08，MgSO4·7H2O 0.20，CaCl20.02，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

餐厨废水［3］（g/L）：花生油0.05，洗涤剂0.05，乙酸钠1.28，NaCl 0.15，NaHCO30.03，NH4Cl 0.29，KNO30.22，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O 0.01，微量元素2 mL，pH 7.20-7.40。

1.2 方法

1.2.1 反硝化聚磷菌的筛选 10 g泥样于装有玻璃珠的90 mL无菌水中，充分振荡30 min后静置，取1 mL十倍梯度稀释涂布于R2A培养基，设置平行。28℃培养3-4 d，挑取单菌落三区划线法纯化，点接于1% BTB-反硝化培养基，显蓝菌株为初筛菌。

初筛菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃培养48 h，离心收集菌体，无菌水洗涤，重悬调OD600为1.0。以8%（V/V）接种于富氮富磷培养基，28℃培养，定时取样，离心取上清，分别用钼酸铵分光光度法测定总磷（TP）含量（《中华人民共和国国家标准GB 11893-89》），用紫外分光光度法测定硝酸盐氮（NO3--N）含量（《中华人民共和国环境保护行业标准HJ/T 346-2007》），用纳氏试剂分光光度法测定氨氮（NH4+-N）含量（《中华人民共和国环境保护行业标准HJ 535-2009）》，完成复筛。

1.2.2 菌种鉴定 对筛选的高效反硝化聚磷菌，依据《常见细菌系统鉴定手册》进行形态观察和生理生化鉴定［18］。碱裂解法提取菌体DNA，以E.coli27F和1492R为引物PCR扩增16S rRNA基因［19］，琼脂糖凝胶电泳检测后进行核苷酸序列测定，NCBI数据库比对并下载相似度高的序列，MEGA 7.0软件以邻接法构建系统发育树［20］。

1.2.3 生长曲线和脱氮除磷曲线测定 以牛肉膏蛋白胨液体培养基接种菌株D4，150 r/min、28℃培养48 h，离心后无菌水洗涤并重悬（OD600=1.0），以8%（V/V）的接种量接种于富氮富磷培养基，150 r/min、28℃培养，每6 h测OD600及上清液中TP、NO3--N及NH4+-N含量，绘制生长曲线和脱氮除磷曲线。

1.2.4 脱氮除磷条件单因素试验 以富氮富磷培养基为基础培养基，分别考察碳源（葡萄糖、柠檬酸钠、淀粉、丁二酸钠、乙酸钠）、乙酸钠浓度（0.76、1.51、2.26、3.32、4.53 g/L）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，灭菌后用HCl和NaOH调节）、接种量（2%、5%、8%、10%、15%）、温度（20、28、34、37、42℃）和初始磷含量（10、15、20、30、40 mg/L）等单因素水平对菌株脱氮除磷能力的影响。接入菌体为无菌水洗涤后重悬液（OD600为1.0）。28℃（除温度梯度实验外）培养48 h，取样离心，测上清液TP、NO3--N及NH4+-N含量。

依据单因素实验及显著性分析结果，使用Expert Design 11.0对显著影响D4脱氮除磷效率的温度、pH和初始磷含量进行编码，以总磷去除量为响应值，设置N=17的3因素3水平的Box-Behnken实验（表1）。对总磷去除量进行二次多元回归方程拟合，得到各因素与响应值之间函数关系的回归方程，根据生成的响应面图确定最优工艺条件，完成验证试验。

表1 反硝化聚磷菌三因素三水平表Table 1 Three factors and three levels of denitrifying phosphorus-accumulating bacteria

1.2.5 模拟废水的脱氮除磷性能研究 分别以屠宰及肉类加工废水、柠檬酸废水、豆制品废水、餐厨废水为对象，研究菌株D4对食品加工废水的脱氮除磷效果。无菌水洗涤重悬后（OD600=1.0）的D4菌液按5%（V/V）分别接种至200 mL各模拟废水，28℃、150 r/min培养，每隔12 h取样，测定各模拟废水中的TP、TN、NH4+-N含量，绘制脱氮除磷曲线。

2 结果

2.1 反硝化聚磷菌的筛选结果

通过初筛和复筛，得到一株高效反硝化聚磷菌株D4，在富氮富磷基础培养基中，菌株D4的总磷去除量为7.33 mg/L，硝氮去除量为33.93 mg/L，氨氮去除量为58.65 mg/L。

2.2 菌种鉴定结果

反硝化聚磷菌D4在R2A培养基上，呈圆形、橙红色、表面光滑、不透明，菌体细胞为短杆状或近球状，革兰氏染色阳性，吲哚、V-P实验、硝酸盐还原实验阳性，甲基红实验阴性，不能水解淀粉和尿素，不能使明胶液化。16S rRNA基因系统发育分析结果显示（图1），菌株D4与Gordonia hongkongensisHKU50（NR_152022.1）的亲缘关系最近（同源性99.38%），结合生理生化特点，初步确定D4为戈登氏菌（Gordoniasp.）。

图1 菌株D4的16S rRNA基因系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA genes of strain D4

2.3 反硝化聚磷菌D4的生长曲线和脱氮除磷曲线

菌株D4生长曲线及脱氮除磷曲线如图2所示。在富氮富磷培养基中，约0-12 h为生长延滞期，对氮磷元素的消耗维持在较低水平；12-36 h为对数生长期，对氮磷的去除量逐步提高；36 h后生长趋向平稳，对氮磷的去除量也维持在相对稳定水平。

图2 菌株D4的生长曲线和脱氮除磷曲线Fig.2 Growth and nitrogen and phosphorus removal curves of strain D4

2.4 脱氮除磷条件单因素实验结果

2.4.1 碳源 不同碳源对菌株D4的脱氮除磷影响结果表明（图3），同浓度条件下，乙酸钠为菌株D4脱氮除磷的最佳碳源，柠檬酸钠次之。对最佳碳源乙酸钠，设置不同浓度，结果表明，当乙酸钠浓度为3.32 g/L时，D4对总磷、硝氮和氨氮的去除量分别为8.94、28.82和64.32 mg/L，该条件下的除磷效果与乙酸钠4.53 g/L时的差异性不显著（P＞0.05）。当乙酸钠浓度低于3.32 mg/L时，可能由于碳源不足影响菌株的生长进而影响了菌株的脱氮能力。因此选取3.32 g/L乙酸钠为最佳碳源。

图3 碳源及碳源浓度对菌株D4脱氮除磷效率的影响Fig.3 Effects of carbon sources and carbon source concentration on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of strain D4

2.4.2 接种量 接种量对菌株D4脱氮除磷效率的影响如图4所示。5%接种量时，菌株对总磷、硝氮和氨氮去除量最佳，分别为8.94、31.64和62.35 mg/L。接种量低于5%时，菌株可以正常除磷，但脱氮效果受到影响，而接种量高于5%时，菌株对氨氮的去除量逐渐降低。因此选择5%为菌株最佳接种量。

图4 接种量对D4脱氮除磷效率的影响Fig.4 Effects of inoculum size on nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.3 初始磷含量 初始磷含量对菌株D4脱氮除磷效率的影响如图5所示，15 mg/L初始磷含量条件下，菌株D4的脱氮除磷效果最佳，对总磷、硝氮和氨氮的去除量分别为12.89、32.43和62.24 mg/L。初始磷含量低于15 mg/L时，菌株的除磷能力受到限制，当初始磷含量较高时，菌株的去除硝态氮能力降低。因此选择15 mg/L为最适初始磷含量。

图5 初始磷含量对D4脱氮除磷效率的影响Fig.5 Effects of initial phosphorus concentration on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.4 温度 温度对菌株D4脱氮除磷效率的影响如图6所示。28℃培养时，D4对氮磷去除量最高，对总磷、硝氮、氨氮的去除量分别为7.71、28.69和57.41 mg/L，低温不利于该菌株对磷和氨氮的去除，而温度过高不利于该菌株对硝氮的去除。因此选取28℃为菌株D4脱氮除磷的最适温度。

图6 温度对D4脱氮除磷效率的影响Fig.6 Effects of temperature on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.4.5 pH pH值对菌株D4脱氮除磷效率的影响如图7所示。pH 7-8更有利于菌株脱氮除磷，pH 8时，菌株对总磷、硝氮、氨氮的去除量分别为7.89、32.23和58.59 mg/L，此时D4的脱氮除磷能力稍高于pH 7和pH 9时，而当pH值低于7时，菌株除磷能力降低且几乎不具有脱氮能力，可能是酸性环境不利于菌株生长，从而影响了其脱氮除磷能力。选择pH 8为D4脱氮除磷的最适pH。

图7 pH对D4脱氮除磷效率的影响Fig.7 Effects of pH on the nitrogen and phosphorus removal efficiency of D4

2.5 脱氮除磷条件的综合优化结果

根据单因素实验结果及显著性分析（表2），设置N=17的三因素三水平Box-Behnken实验，通过实验拟合，得到总磷去除量（Y）对温度（A）、pH（B）、初始磷含量（C）3个因素的二次多项回归方程为：

表2 显著性分析结果Table 2 Significance analysis results

Y=14.26+1.35A+0.5055B+2.60C-0.6770AB+1.31AC+0.0310BC-1.37A2-1.39B2-1.45C2

根据方差分析（表3），该模型的P＜0.01，说明此模型极显著。模型系数R2为96.59%，表明该模型与实际情况拟合良好，具有统计学意义，可以用来预测反硝化聚磷菌实现最大氮磷去除量的实验条件。3个因素对总磷去除量的影响顺序为初始磷含量＞温度＞pH，其中温度和初始磷含量对响应值影响极显著（P＜0.01），pH对响应值的影响不显著（P＞0.05）。

表3 二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic model

用Design-Expert 11.0软件对响应面实验结果进行绘图（图8）表明，随着温度和pH的升高，D4对总磷去除量先增加后减少，温度和pH之间存在着较强的交互作用；随着温度和初始磷含量的升高，D4对总磷去除量先增加后减少。随着pH和初始磷含量的升高，菌株D4对总磷去除量先增加后减少；当温度、pH值和初始磷含量分别为31.3℃、pH 7.9、18.61 mg/L时，响应值最大，预测总磷去除量为16.20 mg/L。

图8 各因素交互作用对总磷去除量的响应曲面图Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors on total phosphorus removal

对响应面法得到的最佳脱氮除磷条件进行验证，结果表明，菌株D4对总磷、硝氮和氨氮的实际去除量分别为14.18、39.67 和69.71 mg/L，总磷去除量与预测值基本吻合，三者的去除量比优化前分别提高了6.85、5.74和11.06 mg/L。

2.6 菌株D4对食品模拟废水的脱氮除磷效果

菌株D4对不同食品模拟废水的脱氮除磷结果表明（图9），D4对豆制品废水脱氮除磷效果最好，总磷、总氮和氨氮的去除量分别达到11.05、101.58和100.28 mg/L；对屠宰厂及肉类加工废水中的总磷、总氮和氨氮的去除量次之，分别为10.40、92.73和77.70 mg/L；对柠檬酸废水中的总磷、总氮和氨氮的去除量分别为5.48、21.33和19.95 mg/L。对餐厨废水中的总磷、总氮和氨氮的去除量分别为3.48、31.19和22.33 mg/L。

图9 菌株D4对不同模拟废水中总磷（a）、总氮（b）、氨氮（c）的去除量Fig.9 Removed amount of total phosphorus (a), total nitrogen (b), ammonia nitrogen (c) in different simulated wastewater by bacterial strain D4

3 讨论

当前废水处理所用的反硝化聚磷菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis）、不动杆菌属（Acinetobacter）和陶厄氏菌（Thauera）等［10-14］。本研究所筛选的高效反硝化聚磷菌戈登氏菌（Gordoniasp.），有报道用于脱硫和烃类降解［21］以及污染物的生物修复等方面［22］，关于废水脱氮除磷的研究少有报道。

不同菌株对营养和环境的要求有所不同。本研究结果表明，在不同碳源条件下，戈登氏菌D4的生长和脱氮除磷能力均受到影响，乙酸钠为碳源时其脱氮除磷能力最佳，与其他脱氮除磷菌相似，如不动杆菌（Acinetobactersp.）［14］等。接种量5%最佳，过低时导致微生物生物量较低，使脱氮除磷能力受到限制，当接种量过高时，则可能出现营养物质不足难以维持微生物的生长，从而影响脱氮效率［11］。初始磷含量影响微生物的生长和除磷效率，当初始磷含量低于15 mg/L时，体系中总磷含量低于D4的最大除磷能力，所以菌株的除磷能力受到限制，当初始磷含量超过20 mg/L并逐渐升高时，D4的除磷能力没有受到显著影响，脱氮能力有所降低，这一现象与Xu［11］等筛选出的大肠杆菌（Escherichia coli）J16恰好相反。已有研究表明，反硝化聚磷菌可以利用NO3-、NO2-和O2作为电子受体进行脱氮作用［23］。在厌氧条件下，胞内多聚磷酸盐（ploy-P）水解为PO43-释放到环境中，在好氧或缺氧条件下以O2或NO3-、NO2-为电子受体，同时吸取环境中的PO43-合成ploy-P储存在胞内。在此过程中菌株受到硝酸还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶等多种酶类调节［24］，因此对外界环境因素变化较为敏感。本研究中，温度低于28℃时，菌株的除磷能力受到影响，当温度超过34℃时，菌株对硝态氮的去除能力随着温度的升高而越低。在pH 5-8，随着pH的升高，D4的脱氮除磷能力也逐渐升高，且pH 8时D4的脱氮除磷效果最好。目前已报道的多数反硝化聚磷菌的最适生长温度均较为温和（25-37℃），最适pH值为中性或弱碱性（pH 6-9）［25-26］。

脱氮除磷能力方面，当前所报道的反硝化聚磷菌还远不能满足实际应用需求。有研究表明，一般食品加工废水中总磷含量约为20-100 mg/L，总氮含量约为100-400 mg/L［27-28］，这些废水在经过滤、调节pH和生物厌氧发酵分解后，进入生物反应池进行脱氮除磷，但目前报道的反硝化聚磷菌脱氮除磷能力还有待提高。聂毅磊等［29］筛选出的Achromobactersp.以琥珀酸钠为唯一碳源，28℃培养30 h的除磷量为1.97 mg/L，脱氮量为2.76 mg/L，靳茹［30］筛选出的大肠杆菌以乙酸钠为唯一碳源，30℃培养24 h的除磷量为8.01 mg/L，脱氮量为62.10 mg/L。王春雷［16］筛选出的反硝化聚磷菌株J3以乙酸钠为唯一碳源，30℃培养7 d的除磷量为3.00 mg/L，脱氮量为30.10 mg/L。本研究中戈登氏菌D4以乙酸钠为唯一碳源，31.3℃培养48 h的除磷量为14.18 mg/L，对硝态氮和氨氮的去除量分别为39.67 mg/L和69.71 mg/L，相应去除率为84.50%、97.67%和96.22%，在废水脱氮除磷能力上具有较大的优势，且对高氮高磷废水的处理有良好效果，具有较好的应用前景。

4 结论

本研究筛选出一株高效反硝化聚磷菌株戈登氏菌（Gordoniasp.）D4，最佳脱氮除磷条件为3.32 g/L乙酸钠为碳源、接种量5%、初始磷含量18.61 mg/L、31.3℃、pH 7.9，此条件下对总磷、硝氮、氨氮去除量分别达14.18、39.67和69.71 mg/L。该菌株对屠宰及肉类加工废水、柠檬酸废水、豆制品废水及餐厨废水等均具有良好的脱氮除磷效果。