miR-204-5p靶向调控BCL2L2促进急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的研究

王 坤 朱传龙 田健美 孔小行 成芳芳 李 嫣

急性肝衰竭(acute liver failur,ALF)是由各种病原体感染,各种物质中毒等原因引起的肝细胞亚大片或大片凋亡、坏死,致使其各种生物学功能严重受损或失代偿的一种临床症候群,临床病死率高[1]。由于缺乏理想的早期病情评估指标和有效的药物治疗方案,急性肝衰竭的临床评估与有效治疗仍然是世界性的难题[2]。目前急性肝衰竭常用的治疗方法为内科治疗,包括保肝、呼吸循环支持、血浆置换等治疗,但疗效仍有限[3]。肝移植仍是当前该疾病最有效的治疗方法,但由于供肝缺乏、医疗费用高昂等问题限制该方法的广泛开展[4]。因此,进一步寻找一种新的方式早期诊断评估、治疗急性肝衰竭至关重要。有研究表明,基因治疗是一种很有前途的治疗方式,可用于治疗多种疾病,并且能提高治疗的疗效和患者的生存率[5]。

微小RNA(miRNA)是一类小分子非编码单链RNA,由约22个核苷酸组成,它通过与mRNA的3′-非转录区域(3′-UTR)结合,在转录或转录后水平调控靶基因的功能,抑制靶基因的表达,在调控体内的蛋白质编码基因的表达中发挥重要作用[6]。既往研究表明,miRNA不仅可以作为肝衰竭的早期诊断指标,也在肝衰竭炎性反应、肝细胞坏死、凋亡和肝细胞再生过程中发挥着重要的调控作用[7]。因此,通过探索这些miRNAs,可能会获得疾病早期诊断和靶向治疗的新线索。

材料与方法

1.实验动物:雄性SD大鼠42只,6周龄,体质量为200～220g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号:SCXK(沪)2017-0005。本实验中所有的实验动物被饲养于苏州大学动物实验中心,SPF级饲养环境,动物实验经苏州大学实验动物伦理委员会批准进行,实验动物使用许可证:SYXK(苏)2017-0043。

2.主要实验试剂:D-氨基半乳糖、脂多糖购自美国Sigma公司;丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)检测试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒及总胆红素(total bilirubin,TBIL)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;TRIzol购自美国Invitrogen公司;cDNA第一链合成试剂盒购自日本TaKaRa公司;全蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;兔anti-BCL2L2、羊抗兔IgG-HRP购自江苏亲科生物研究中心有限公司;引物、miR-204-5p模拟物(miR-204-5p mimic)、pmirGLO-BCL2L2-WT、pmirGLO-BCL2L2-MUT报告载体均由江苏凯基生物技术股份有限公司构建完成。

3.急性肝衰竭大鼠模型建立、分组:取32只6周龄雄性SD大鼠,以随机数字表法平均分成对照组(0h)、模型组(24h)、模型组(48h)、模型组(72h),每组各8只[模型组(72h)的大鼠在造模不足72h有死亡的情况,此时再随机选取6周龄雄性SD大鼠补充入组,完成造模],对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液,模型组采用D-氨基半乳糖(D-GalN,剂量为950mg/kg)和脂多糖(LPS,剂量为10μg/kg)依次腹腔注射制造大鼠急性肝衰竭模型,分别取对照组及模型组造模完成后24、48、72h大鼠静脉血及肝组织。另取10只6周龄雄性SD大鼠,行上述急性肝衰竭造模后,观察大鼠生存情况。

4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清ALT、AST、TBIL值:内眦静脉采取4组大鼠静脉血,采血完成后,置于离心机中,4℃、3000r/min离心10min。收集上层血清,严格按照试剂盒所附说明书的操作检测。

5.苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠肝组织病理变化及行炎症活动指数(histology activity index,HAI)评分:4组大鼠肝组织标本收集后,将其放入10%的甲醛溶液中固定72h,然后用乙醇脱水,石蜡包埋,切片,切片厚度为4μm。组织切片经脱蜡,水化,行HE染色,封片后置于200倍光镜显微镜下观察肝脏病理变化并拍照,并采用HAI评分系统对各组肝脏组织炎症坏死凋亡等情况进行评分。

6.实时荧光定量PCR(RT -PCR) 检测miR-204-5p、BCL2L2表达水平:取出4组肝脏组织,使用Trizol法提取肝脏组织总RNA,用反转录试剂盒进行RNA反转录合成互补DNA(cDNA),建立荧光定量PCR体系。以U6为miR-204-5p内参,GADPH为BCL2L2内参,采用2-Δ ΔCt计算miR-204-5p、BCL2L2相对表达量。miR-204-5p上游引物:5′-ACACTCCAGCTGGGUUCCCUUUGUCAUCCU-3′,下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;BCL2L2上游引物:5′-AGTCTGTCATCCTTGCCCCTTT-3′,下游引物:5′-GCTCCACAGACATAACCCTTCT-3′;GADPH上游引物:5′-AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA-3′;下游引物:5′-CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG-3′。

7.Western blot法检测4组大鼠肝组织中BCL2L2蛋白表达情况:采用RIPA裂解液裂解肝组织,离心后取上清液采用BCA法检测样本蛋白含量,用GADPH作为内参,使用12% SDS-PAGE电泳分离蛋白,转膜封闭后加入一抗(兔anti-BCL2L2)孵育过夜,加入羊抗兔IgG-HRP二抗,室温反应2h,TBsT洗膜后使用超敏ECL发光液孵育PVDF膜进行显影,保存图片,采用Imagel J软件分析条带灰度值。

8.TUNEL法检测肝细胞凋亡:取4组肝脏组织石蜡切片,脱蜡水化后每张切片滴加蛋白激酶K及TdT酶反应液,避光反应1h,清洗后滴加Streptavadin-HRP,避光反应30min,洗涤后行DAB显色及苏木精复染,冲洗干净,晾干后封片,选取5个400倍镜下视野,每个高倍视野计数100个细胞,计数各视野的凋亡指数。凋亡指数(%)=各视野阳性细胞数/100×100%。

9.双荧光素酶报告基因实验验证miR-204-5p与BCL2L2之间的靶向关系:通过Targetscan数据库分析miR-204-5P的靶基因可能是BCL2L2,分别将BCL2L2-WT、BCL2L2-MUT质粒与miR-204-5pmimics、mimics-NC共转染至293T细胞中,转染48h后,收集各组细胞并参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞的荧光素酶活性。

结 果

1.4组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平的变化:与对照组比较,行急性肝衰竭造模后的大鼠血清ALT、AST及TBIL值均随造模时间延长逐渐升高,且差异有统计学意义(P<0.05),肝功能损伤明显,详见表1。

表1 4组大鼠血清ALT、AST及TBIL值水平

2.4组大鼠肝组织病理变化:大鼠行急性肝衰竭造模24h后,200倍光镜视野下观察肝组织病理可发现肝细胞水肿、点状变性坏死及炎性渗出,随着造模时间的延长,大鼠的肝脏坏死程度逐渐加重,在造模后72h观察其肝脏病理可见肝细胞发生大片状坏死,结构遭到严重破坏及有大量炎性细胞浸润,详见图1A。此外,随着造模时间的延长,HAI评分逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.001),详见图1B。

图1 4组大鼠肝组织病理情况A.4组大鼠肝组织病理变化(HE,×200);B.4组大鼠肝组织相应HAI评分

3.大鼠行急性肝衰竭造模后生存率:取10只SD大鼠行急性肝衰竭造模,研究发现,造模12h后大鼠的活力下降,活动度减少;24h后部分大鼠出现精神萎靡、食纳减少、触碰反应差等表现,造模48h内即有大鼠出现死亡,后大鼠陆续出现死亡,所有造模大鼠均在5天内死亡,详见图2。

图2 急性肝衰竭大鼠造模后生存情况

4.4组大鼠肝组织中miR-204-5p、BCL2L2的表达情况:RT-PCR检测显示,模型组大鼠肝组织中miR-204-5p的相对表达水平显著高于对照组,且随着大鼠行急性肝衰竭造模后时间推移,肝组织中miR-204-5p基因的相对表达水平逐渐升高(各组表达量分别为1.26±0.29、1.76±0.21、2.99±0.32、4.30±0.88),详见图3A;而肝组织中BCL2L2基因的相对表达水平逐渐降低(各组表达量分别为0.95±0.10、0.56±0.07、0.34±0.07、0.13±0.06),详见图3B。Western blot法检测结果显示,肝组织中BCL2L2蛋白表达亦逐渐降低,详见图3C,差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图3 4组大鼠肝组织中miR-204-5p、BCL2L2表达情况A.4组大鼠肝组织中miR-204-5p基因的相对表达水平;B.4组大鼠肝组织中BCL2L2基因的相对表达水平;C:4组大鼠肝组织中BCL2L2蛋白表达情况

5.4组大鼠肝细胞凋亡情况:通过TUNNEL法检测各组肝细胞的凋亡情况,结果显示,随着造模时间的延长,肝组织中凋亡的肝细胞显著增多,差异有统计学意义(P<0.05),详见图4。

6.miR-204-5p靶向BCL2L2:miR-204-5p表达水平与BCL2L2表达水平呈负相关(R2=0.752,P<0.001),详见图5A。生物信息学预测显示,miR-204-5p与BCL2L2之间存在互补的结合位点,详见图5B。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示,与阴性对照mimics-NC组比较,miR-204-5p mimics与BCL2L2-WT质粒共转染后细胞的相对荧光素酶活性明显降低(P<0.001),详见图5C。

结 果

急性肝衰竭是临床上导致高病死率的严重临床综合征,既往研究指出,肝细胞凋亡与急性肝衰竭关系十分密切,大量肝细胞凋亡在急性肝衰竭疾病发展过程中起了重要的作用[8]。因此,抑制肝细胞凋亡是防治急性肝衰竭的重要途径。在本研究中,大鼠行急性肝衰竭模型造模,造模完成后,可见随造模时间的延长,大鼠肝功能急剧恶化;且完善肝组织病理检测可见随着造模时间的延长,大鼠的肝脏坏死程度逐渐加重,在造模后72h即可发现肝细胞发生大片状坏死,肝组织结构遭到严重破坏及有大量炎性细胞浸润。行大鼠急性肝衰竭造模后生存率分析显示,所有造模大鼠均在5天内死亡,上述结果均提示大鼠急性肝衰竭模型造模成功。

既往研究表明,miRNA参与急性肝衰竭的发生、发展[9]。miR-204-5p定位于人类第9号染色体73424891～73425000位之间,且该基因已被证实在许多癌症中具有肿瘤抑制作用,如结直肠癌和胃癌,以及在多种疾病中具有调节炎性反应及氧化应激的作用,促进疾病发生、发展[10～13]。多项研究发现,miR-204-5p参与细胞凋亡和炎症损伤的调节,被认为是细胞凋亡的正调控因子[14,15]。本研究成功制造急性肝衰竭大鼠模型,并发现随着急性肝衰竭的发生、发展,急性肝衰竭大鼠肝功能损伤及肝细胞凋亡、坏死越重,其肝组织中miR-204-5P的相对表达水平逐渐升高。因此,miR-204-5p可能是急性肝衰竭发病机制中重要的调节因子,成为诊断及治疗急性肝衰竭的新的潜在靶点,可作为评估急性肝衰竭严重程度的指标,有助于早期评估患者病情,预测急性肝衰竭的发生、发展。

如前所述,miRNA通过调控靶基因的表达发挥作用。Bcl-2样蛋白2(Bcl-2 like protein 2,BCL2L2)属于Bcl-2蛋白家族成员,是一种控制细胞存活的抗凋亡蛋白,是细胞活力的关键调节因子。BCL2L2蛋白对于内在的凋亡途径至关重要,在caspase依赖的细胞凋亡的调控中起着调节作用,BCL2L2通过抑制线粒体细胞色素c和caspase-3依赖的蛋白水解级联反应,维持线粒体膜的完整性,保护细胞免于凋亡[16,17]。近年来,越来越多的研究集中在miRNA对BCL2L2的调控上,通过抑制BCL2L2的表达,促进细胞凋亡[18,19]。本研究中,急性肝衰竭大鼠肝组织中BCL2L2的表达水平显著低于正常大鼠肝组织,且随着大鼠急性肝衰竭造模后时间的推移,肝组织中BCL2L2基因的表达水平逐渐降低,且肝组织中凋亡的肝细胞逐渐增加。miR-204-5p表达水平与BCL2L2表达水平呈负相关,且通过生物信息学分析提示了miR-204-5p和BCL2L2的靶向结合关系,并采用双荧光素酶报告基因实验进一步证实了miR-204-5p和BCL2L2之间存在靶向关系。因此,miR-204-5p可与BCL2L2mRNA的 3′非编码区结合,抑制BCL2L2表达,进而促进肝细胞凋亡,促进急性肝衰竭的发生及病情进展。

本研究也存在一定的局限性,首先,本实验的样本量较小,其次本实验未设置miR-204-5p 抑制剂组(miR-204-5p inhibitor)、miR-204-5p模拟物组(miR-204-5p mimic)等尾静脉注射急性肝衰竭大鼠,进一步验证miR-204-5p靶向调控BCL2L2的关系。因此,在后续的工作中,将加大实验大鼠样本量及完善上述相关实验,进一步评估验证miR-204-5p靶向调控BCL2L2促进急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的机制。

综上所述,本研究发现,急性肝衰竭大鼠肝组织中miR-204-5p的相对表达水平随着造模时间的延长逐渐升高,miR-204-5p通过靶向调控BCL2L2促进肝细胞凋亡,进而促进急性肝衰竭疾病的发生、发展。因此,miR-204-5p可成为早期诊断、评估及治疗急性肝衰竭的新的潜在靶点。