乳腺癌组织lncRNA LINC00467和miR-4735-3p表达水平与术后复发转移的相关性

张硕稳 李 丹 贺 静 杜志兴 郑丽华 刘永建

乳腺癌是继肺癌之后女性癌症相关死亡的第二大原因,全球发生率超过200万例,并且每年以0.3%的速度增长[1]。因此,寻找能够有效预测乳腺癌预后的新的生物学标志物有利于更精确地诊断和开发更好的临床治疗靶点。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可以参与调节各种生理和病理过程,如细胞增殖、凋亡、侵袭等[2]。近年来研究显示,lncRNA在癌症中异常表达,可作为早期筛查、治疗及预后的生物学标志物,其中lncRNA LINC00467作为肿瘤促进基因参与各种类型的癌症。例如,lncRNA LINC00467在结直肠癌组织和细胞中高表达,敲除后可在体外抑制结直肠癌细胞的增殖和转移,可作为潜在的预后生物学标志物,在结直肠癌的进展中至关重要[3]。微小RNA(microRNA, miRNA)在基因表达的转录后调控中发挥重要作用,其表达异常影响肿瘤细胞的生长和转移,miR-4735-3p是研究较少的家族成员之一,之前在膀胱癌细胞中的研究发现其具有抗肿瘤作用[4～6]。lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在癌症中具有重要作用,但在乳腺癌中的研究尚未见报道,本研究检测了lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在乳腺癌组织中的表达情况,旨在分析其表达水平与乳腺癌患者临床预后复发转移的关系,为寻找乳腺癌临床治疗靶点和预后指标提供新的见解。

对象与方法

1.一般资料:回顾性选取2017年4月～2019年4月于河北医科大学第一医院接受乳腺癌改良根治术治疗的109例乳腺癌患者,均为女性,患者年龄31～68岁,平均年龄为50.07±9.65岁;肿瘤最大径0.53～5.23cm,平均最大径为3.14±0.96cm;肿瘤分化程度:低分化31例,中分化48例,高分化30例;TNM分期[7]:Ⅰ期38例,Ⅱ期42例,Ⅲ期29例。在手术过程中收集乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织(经病理诊断),立即置于液氮中短暂保存,术后保存至-80℃超低温冰箱直至使用。本研究经河北医科大学第一医院医学伦理学委员会批准(伦理学审批号:LS-2017第63号),患者均签署知情同意书。

2.纳入与排除标准:纳入标准:①患者均参照《乳腺癌诊疗规范(2018年版)》中的乳腺癌诊断标准确诊[7];②均为初诊病例,术前未进行过乳腺癌的相关治疗;③术前检查证实均不存在远处转移。排除标准:①术前接受过其他治疗的患者;②全身性感染或合并其他恶性疾病的患者;③不配合治疗的患者。

3.总RNA提取和反转录:取出冻存的乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织解冻,使用TRIzol试剂盒(批号:RK90273J,上海通蔚生物科技有限公司)提取总RNA,并通过核酸蛋白仪(型号:NanoDrop One/OneC,上海嘉鹏科技有限公司)评估RNA的纯度(A260/A280>1.8)。使用反转录试剂盒(批号:LK90172,上海嘉鹏科技有限公司)将大约1μg的总RNA反转录为cDNA,-20℃条件下保存备用。

4.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技术检测lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平:以GAPDH和U6作为内参,RT-qPCR分析的所有引物由上海通蔚生物科技有限公司合成,引物序列详见表1。根据RT-qPCR试剂盒(批号:LK35172,上海嘉鹏科技有限公司)的说明书,在RT-qPCR仪(型号:CFX130,上海巴玖实业有限公司)上进行反应,反应条件如下:95℃预变性30s,随后95℃变性5s,60℃退火30s,循环45次。检测得到的数据使用2-ΔΔCt方法计算lncRNA LINC00467(内参GAPDH)和miR-4735-3p(内参U6)的相对表达水平。

表1 RT-qPCR引物序列

5.随访乳腺癌预后复发转移情况:对所有患者进行3年的术后随访,主要是通过门诊复查的方式,随访时间从手术当天开始,随访截止日期为2022年4月30日,主要记录术后乳腺癌复发转移情况。

结 果

1.乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平比较:与癌旁正常乳腺组织比较,乳腺癌组织lncRNA LINC00467表达水平较高,miR-4735-3p表达水平较低(P<0.05,表2)。

表2 乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平比较

2.复发转移组和未复发转移组患者的临床资料比较:随访结果显示3例患者失访,31例出现复发转移(复发转移组),75例未出现复发转移(未复发转移组)。复发转移组和未复发转移组患者的年龄、肿瘤最大径及肿瘤分化程度比较,差异无统计学意义(P>0.05),而TNM分期比较,差异有统计学意义(P<0.05,表3)。

表3 复发转移组和未复发转移组患者的临床资料比较

3.复发转移组和未复发转移组乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平比较:与未复发转移组比较,复发转移组乳腺癌组织lncRNA LINC00467表达水平较高,miR-4735-3p表达水平较低(P<0.05,表4)。

表4 复发转移组和未复发转移组乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平比较

4.乳腺癌组织lncRNA LINC00467与miR-4735-3p表达水平的相关性:经ENCORI数据库预测,lncRNA LINC00467与miR-4735-3p存在相应的结合位点(图1);乳腺癌组织lncRNA LINC00467与miR-4735-3p表达水平呈负相关(r=-0.492,P=0.000,图2)。

图1 lncRNA LINC00467与miR-4735-3p靶向关系预测

图2 乳腺癌组织lncRNA LINC00467与miR-4735-3p表达水平的相关性分析

5.影响乳腺癌患者术后3年内复发转移的因素分析:以乳腺癌患者术后3年内是否发生复发转移(发生=1,未发生=0)作为因变量,以表3和表4中差异有统计学意义的指标,即以TNM分期(Ⅰ期=0,Ⅱ期=1,Ⅲ期=2)及乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平(连续变量)作为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果显示,TNM Ⅲ期及lncRNA LINC00467表达水平是影响乳腺癌患者术后3年内复发转移的独立危险因素,而miR-4735-3p表达水平是保护因素(P<0.05,表5)。

表5 影响乳腺癌患者术后3年内复发转移的多因素Logistic回归分析

6.乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平对术后3年内复发转移的预测价值:ROC曲线分析结果显示,乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p以及两者联合预测术后3年内复发转移的AUC分别为0.784、0.842、0.943;两者联合预测变量方程为z=0.498×lncRNA LINC00467-0.327×miR-4735-3p-8.154,两者联合优于lncRNA LINC00467、miR-4735-3p单独预测(z=2.863、2.016,P=0.004、0.044,详见图3和表6)。

图3 乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平预测术后3年内复发转移的ROC曲线

表6 乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平对术后3年内复发转移的预测价值

结 果

乳腺癌患者的早期筛查和临床治疗手段已取得了一定的进展,但其耐药性、转移和复发仍然是最主要的障碍,导致乳腺癌患者的预后较差[8]。乳腺癌的治疗手段通常与患者预后有关,随着特效药的临床使用,患者的生存率得到提高[9]。故亟需一种有效的预后生物学标志物,为研究新的乳腺癌的临床治疗措施提供参考。

lncRNA和miRNA是基因表达的主要调节因子,并且是癌症发病机制中的重要功能介质[10, 11]。lncRNA通过直接或间接相互作用促进癌症的发生、发展、复发和耐药性,可以作为潜在的有效生物学标志物[12]。lncRNA LINC00467是一种新型的lncRNA,其表达升高能够促进肿瘤细胞存活并抑制细胞凋亡,在神经母细胞瘤、食管癌等多种肿瘤中发挥相似的功能,作为致瘤基因参与癌症的发生和进展,被视为一个潜在的癌症预后标志物[13]。本研究结果显示,lncRNA LINC00467在乳腺癌组织中表达上调,与之前报道的观点一致,可能在乳腺癌中具有肿瘤促进作用,表明lncRNA LINC00467的表达失调可能与乳腺癌的发病机制存在一定的关联[13, 14]。

与lncRNA一样,miRNA在大多数癌症中也表达失调,包括乳腺癌[15]。最近有报道称lncRNA可以通过影响miRNA参与调控基因的表达,进而调节各种类型的癌症[16, 17]。Teng等[6]和Li等[18]研究显示,lncRNA ARAP1-AS1与miR-4735-3p结合调控下游靶基因表达从而调节膀胱癌和卵巢癌的进展,并且表明miR-4735-3p能够抑制膀胱癌肿瘤细胞的迁移和侵袭,在膀胱癌细胞中具有抗癌作用。本研究结果显示,与癌旁正常乳腺组织比较,miR-4735-3p表达水平在乳腺癌组织中下调,表明其在乳腺癌中可能具有肿瘤抑制作用。lncRNA和miRNA之间的相互作用在乳腺癌的进展和复发等方面起着至关重要的作用[12,19]。本研究利用ENCORI数据库网站,预测lncRNA LINC00467与miR-4735-3p有相应的结合位点。因此,本研究进一步分析两者的相关性,结果显示,乳腺癌组织中lncRNA LINC00467与miR-4735-3p表达水平呈负相关,随着lncRNA LINC00467的表达上调,miR-4735-3p的表达降低。说明lncRNA LINC00467可能通过负向调节miR-4735-3p在乳腺癌的进展中发挥关键作用,下一步笔者将通过体内和体外实验验证两者的关系。

乳腺癌的治疗效果可能受到潜在发病机制的限制,结合lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在乳腺癌组织中的表达情况,本研究分析了两者与乳腺癌患者术后3年内复发转移的关系,结果显示,复发转移组乳腺癌组织lncRNA LINC00467表达水平较未复发转移组高,miR-4735-3p的表达水平较未复发转移组低,表明lncRNA LINC00467异常升高可能与乳腺癌患者术后3年内复发转移的发生有关。关于lncRNA LINC00467高表达与不良预后密切相关的研究在结直肠癌和骨质瘤等癌症中均有报道[3,20]。本研究结果显示,乳腺癌组织lncRNA LINC00467表达水平是影响乳腺癌患者术后3年内复发转移的独立危险因素,与以往的研究类似,提示lncRNA LINC00467的高表达可能与乳腺癌患者术后3年内复发转移有关,可作为评估乳腺癌患者术后复发转移的潜在指标。目前关于miR-4735-3p在临床中的研究较少,本研究结果显示,乳腺癌组织miR-4735-3p表达水平是影响乳腺癌患者术后3年内复发转移的保护因素,其表达水平越低,越容易发生复发转移。此外,本研究还绘制了ROC曲线,结果显示,乳腺癌组织lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表达水平用于预测乳腺癌患者术后3年内复发转移具有较好的价值,且两者联合具有更高的AUC,敏感度也相应提高,更有利于评估乳腺癌患者术后3年内复发转移情况。

综上所述,乳腺癌组织中lncRNA LINC00467高表达,miR-4735-3p低表达,两者均可用于预测乳腺癌患者术后3年内复发转移,且两者联合预测价值更高,推测lncRNA LINC00467可能负向调节miR-4735-3p参与乳腺癌的进展,但本研究使用的样本量较小,可能使结果具有局限性,后期将开展大样本量研究对其发病机制进行深入探讨。