温阳振衰颗粒调控miR-155/p38MAPK途径减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤机制研究

张 驰,李奥博,王心怡,王沛昕

(1.北京大学第三医院,北京 100621;2.北京丰台右安门医院,北京 100069;3.北京丰台医院,北京 100071)

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是指缺血心肌获得血流再灌注后发生的损伤,常见于冠状动脉旁路移植手术、急性心肌梗死介入手术等,可增加手术后再发心肌梗死、恶性心律失常、心源性猝死的风险[1]。因此,防治MIRI成为了心血管领域研究的热点。近些年,中医药在心血管疾病治疗中的价值受到越来越多关注,温阳振衰颗粒是湖南中医药大学研发的中药颗粒剂,由附子、干姜、甘草、红参等组成,有扶阳破阴、逐寒救逆的功效,已经在慢性心衰、阿霉素诱导心肌损伤模型中被证实其能够减轻心肌损伤,并且通过调控miR-155/p38MAPK通路发挥心肌保护作用[2-3]。但温阳振衰颗粒在MIRI中的应用价值及作用机制尚不清楚。miR-155靶向抑制p38MAPK的作用已经在树突状细胞、神经细胞中被证实[4-5];而在肾脏、心肌等组织缺血再灌注的过程中,p38MAPK通路的激活介导了促炎因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的释放,进而促进炎症反应的级联放大[6-7]。基于此,推测miR-155/p38MAPK轴可能在MIRI过程中起重要作用,能够调控miR-155/p38MAPK轴的温阳振衰颗粒可能在MIRI过程中起治疗作用。故本研究建立大鼠MIRI模型,具体分析温阳振衰颗粒调控miR-155/p38MAPK途径减轻MIRI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:成年雄性SD大鼠64只,购自上海吉辉实验动物饲养有限公司,10～12周龄,体重200～250 g,生产许可证号:SCXK(沪)2017-0012。

1.1.2 实验试剂:温阳振衰颗粒由制附子、干姜、茯苓、红参、麦冬、五味子、甘草组成,购自湖南中医药大学第一附属医院;miR-155抑制剂、模拟物及阴性对照序列购自上海吉玛公司;磷酸肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、TNF-α、IL-6酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自上海酶联公司;miRNA提取及检测试剂盒购自北京天根公司;蛋白裂解液购自北京索莱宝公司;p-p38MAPK一抗购自CST公司。

1.1.3 实验仪器:多功能酶标仪购自美国Bio-tek公司;凝胶电泳系统及成像系统购自上海牧德如公司;荧光定量PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 建模、分组及干预:①miR-155/p38MAPK通路在心肌MIRI损伤中的作用:32只大鼠随机分为阴性对照组、阴性对照+MIRI组、miR-155抑制剂+MIRI组、miR-155模拟物+MIRI组,每组8只;四组大鼠予30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后打开胸腔,暴露心脏,分别在左心室前壁6个点给予阴性对照腺病毒、miR-155抑制剂腺病毒、miR-155模拟物腺病毒1×109PFU局部注射。4 d后造模,阴性对照组进行假手术操作,30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后打开胸腔,暴露心脏,分离左冠状动脉前降支并穿线,但不结扎;其余各组均进行MIRI造模,30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后打开胸腔,暴露心脏,分离左冠状动脉前降支并穿线,将1.5 mm乳胶管放置在缝线与冠脉之间,结扎缝线使心肌缺血30 min,而后取出乳胶管,使心肌再灌注12 h,然后收集心肌及血样进行后续检测。②温阳振衰颗粒通过miR-155/p38MAPK途径减轻心肌MIRI损伤:32只大鼠随机分为对照组、MIRI组、中药组、中药+miR-155抑制剂组,每组8只。对照组和MIRI组大鼠给予0.9%氯化钠溶液灌胃,中药组和中药+miR-155抑制剂组给予2.88 g/(kg·d)温阳振衰颗粒灌胃,连续灌胃14 d;中药+miR-155抑制剂组在灌胃第10 d时予30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后打开胸腔,暴露心脏,在左心室前壁6个点给予miR-155抑制剂的腺病毒1×109PFU局部注射。末次灌胃后次日进行造模,对照组进行假手术操作,其余三组进行MIRI造模,收集心肌及血样进行后续检测。

1.2.2 血清心肌酶含量检测:取血清样本,采用ELISA试剂盒检测CK-MB、LDH含量,按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 心肌miR-155表达水平检测:取缺血再灌注部位的心肌组织适量,采用miRNA提取分离试剂盒提取组织样本中的miRNA,而后将miRNA逆转录为对应的cDNA,最后采用miRNA荧光定量检测试剂盒对cDNA中的miR-155及U6进行扩增。PCR反应体系如下:cDNA 2 μl,试剂盒内的Mixture 10 μl,上游引物0.6 μl,通用下游引物0.6 μl,去离子水补足至20.0 μl。PCR反应程序如下:95 ℃预变性3 min,95 ℃ 5 s、60 ℃ 15 s重复40个循环,根据循环曲线以U6为内参计算miR-155的表达量。

1.2.4 心肌p-p38MAPK表达检测:取缺血再灌注部位的心肌组织适量,加入蛋白裂解液提取蛋白样本,测定蛋白浓度后,将含有30 μg蛋白的样本用于Western blot检测,加入预先配制的聚丙烯酰胺凝胶后进行电泳、电转PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,1∶1000稀释的p-p38MAPK一抗或1∶4000稀释的β-actin一抗4 ℃孵育过夜;次日,1∶2000稀释的二抗室温孵育2 h,最后在凝胶成像系统中显影得到p-p38MAPK和β-actin,以β-actin蛋白条带的灰度值作为内参计算p-p38MAPK表达水平。

1.2.5 心肌炎症因子含量检测:取缺血再灌注部位的适量心肌组织,采用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6水平,按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件分析数据。计量资料采用均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 过表达及敲低miR-155对MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK通路的影响 见表1(图1)。与阴性对照组比较,阴性对照+MIRI组大鼠心肌组织miR-155表达明显降低,p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.05);与阴性对照+MIRI组比较,miR-155抑制剂+MIRI组大鼠心肌miR-155表达明显降低,p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.05);与阴性对照+MIRI组比较,miR-155模拟物+MIRI组大鼠心肌miR-155表达明显增加,p-p38MAPK表达明显降低(均P<0.05)。

图1 各组大鼠心肌组织p-p38MAPK表达电泳图

表1 各组大鼠心肌组织miR-155、p-p38MAPK表达比较

2.2 过表达及敲低miR-155对MIRI大鼠血清心肌酶含量的影响 见表2。与阴性对照组比较,阴性对照+MIRI组大鼠血清CK-MB、LDH含量明显增加(均P<0.05);与阴性对照+MIRI组比较,miR-155抑制剂+MIRI组大鼠血清CK-MB、LDH含量明显增加(均P<0.05),miR-155模拟物+MIRI组大鼠血清CK-MB、LDH含量明显降低(均P<0.05)。

表2 各组大鼠血清CK-MB、LDH含量比较(U/L)

2.3 过表达及敲低miR-155对MIRI大鼠心肌p38MAPK下游炎症因子的影响 见表3。与阴性对照组比较,阴性对照+MIRI组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明显增加(均P<0.05);与阴性对照+MIRI组比较,miR-155抑制剂+MIRI组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明显增加(均P<0.05),miR-155模拟物+MIRI组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明显降低(均P<0.05)。

表3 各组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量比较(ng/mg prot)

2.4 温阳振衰颗粒对MIRI大鼠血清心肌酶含量的影响 见表4。与对照组比较,MIRI组大鼠血清CK-MB、LDH含量明显增加(均P<0.05);与MIRI组比较,中药组大鼠血清CK-MB、LDH含量明显降低(均P<0.05);与中药组比较,中药+miR-155抑制剂组大鼠血清CK-MB、LDH含量明显增加(均P<0.05)。

表4 各组大鼠血清CK-MB、LDH含量比较(U/L)

2.5 温阳振衰颗粒对MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK途径的影响 见表5(图2)。与对照组比较,MIRI组大鼠心肌miR-155表达明显降低,p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.05);与MIRI组比较,中药组大鼠心肌miR-155的表达明显增加,p-p38MAPK表达明显降低(均P<0.05);与中药组比较,中药+miR-155抑制剂组大鼠心肌miR-155表达明显降低,p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.05)。

图2 各组大鼠心肌p-p38MAPK表达电泳图

表5 各组大鼠心肌miR-155、p-p38MAPK表达比较

2.6 温阳振衰颗粒对MIRI大鼠心肌p38MAPK下游炎症因子的影响 见表6。与对照组比较,MIRI组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明显增加(均P<0.05);与MIRI组比较,中药组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明显降低(均P<0.05);与中药组比较,中药+miR-155抑制剂组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量明显增加(均P<0.05)。

表6 各组大鼠心肌TNF-α、IL-6含量比较(ng/mg prot)

3 讨 论

缺血再灌注损伤是冠状动脉旁路移植手术、急性心肌梗死介入手术等过程中心肌必经的病理生理过程,受到炎症反应、氧化应激、凋亡、自噬等因素的影响,可出现MIRI,并增加多种心血管危重并发症的风险[8-11]。近年来,中医药在MIRI防治中的价值受到了越来越多关注。有研究报道,补阳还五汤、益气降浊汤、双参通脉颗粒等中药均能在大鼠MIRI中起到保护作用[12-15]。

温阳振衰颗粒是以附子、干姜、甘草、红参为主要成分的中药颗粒剂。相关研究发现,温阳振衰颗粒在慢性心衰、阿霉素诱导损伤、脓毒症诱导损伤的模型中具有心肌保护作用[2,16-17]。温阳振衰颗粒含药血清通过调控miR-155/p38MAPK途径减轻阿霉素诱导的心肌细胞损伤[3]。miR-155对p38MAPK的靶向调控作用与其抑制MAP3K10、MKK3、MKK6等的激活有关,miR-155靶向抑制p38MAPK的激活能够削弱p38MAPK介导的炎症反应,减少TNF-α、IL-6生成[18-19]。本实验分析MIRI大鼠心肌miR-155/p38MAPK通路的变化可知:MIRI组大鼠心肌miR-155表达降低,p-p38MAPK表达及其下游TNF-α、IL-6含量增加,表明miR-155/p38MAPK通路在MIRI过程中发生改变,下游炎症反应明显激活。在加用温阳振衰颗粒灌胃干预后,中药组大鼠心肌miR-155表达增加,大鼠心肌miR-155表达及其下游TNF-α、IL-6含量降低,表明温阳振衰颗粒参与MIRI过程中miR-155/p38MAPK通路的调控,这可能是温阳振衰颗粒减轻MIRI的分子机制。

中医理论认为MIRI属于胸痹范畴,病机在于阴乘阳位、胸阳痹阻所造成的血脉运行不畅[20-23]。温阳振衰颗粒能够针对MIRI病机发挥扶阳破阴、逐寒救逆的作用,在MIRI中起心肌保护作用[24-25]。本实验采用温阳振衰颗粒灌胃的方式进行干预,灌胃14 d后进行MIRI造模,MIRI组血清心肌酶含量较对照组增加,而中药组血清心肌酶含量较MIRI组降低,表明温阳振衰颗粒能够在MIRI过程中起保护作用、减轻心肌损伤的程度,与该颗粒剂在其他模型中介导的心肌保护作用吻合[26-27]。为阐明温阳振衰颗粒是否通过miR-155/p38MAPK通路减轻MIRI,本研究验证了miR-155在MIRI中的作用。在MIRI造模前分别在心肌局部注射miR-155的抑制物和模拟物,造模后观察心肌损伤程度,结果显示抑制miR-155表达后,MIRI加重且p38MAPK进一步激活,下游TNF-α及IL-6生成进一步增多;而上调miR-155表达后,MIRI减轻且p38MAPK激活减弱,下游TNF-α及IL-6生成减少。以上结果表明miR-155在MIRI中起保护作用,并且能够靶向抑制p38MAPK的激活及下游炎症因子的释放。最后,本研究还通过局部注射miR-155抑制物的方式验证温阳振衰颗粒减轻MIRI的机制,在温阳振衰颗粒灌胃过程中给予miR-155抑制物心肌局部注射,而后进行MIRI造模,造模后观察到抑制miR-155表达能够削弱温阳振衰颗粒减轻MIRI的作用,由此证实温阳振衰颗粒减轻MIRI的作用与上调miR-155表达有关。

综上所述,温阳振衰颗粒通过调控miR-155/p38MAPK途径减轻大鼠MIRI,并且miR-155能够在心肌MIRI过程中靶向p38MAPK,抑制炎症并减轻心肌损伤。