保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞Nephrin、Desmin蛋白表达及细胞凋亡的影响

崔方强,王悦芬,孟 元,蔡 朕,江心灿,赵文景

(首都医科大学附属北京中医医院,北京 100010)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是临床常见疾病,是导致终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。蛋白尿是DN的典型临床表现,同时也是疾病进展的关键病理因素。高糖介导的足细胞损伤在DN蛋白尿的产生中起着至关重要的作用[2]。足细胞损伤表现为足细胞相关蛋白结构功能异常及足细胞凋亡[3]。肾病蛋白(Nephrin)是足细胞重要功能蛋白,结蛋白(Desmin)是足细胞损伤的标志蛋白[4]。高糖可以引起足细胞凋亡,进而导致滤过屏障破坏及蛋白尿[5]。保肾通络方是首都医科大学附属北京中医医院肾病科临床协定处方,被广泛用于DN的临床防治,取得较好的临床疗效。但是保肾通络方对于高糖培养下足细胞Nephrin蛋白、Desmin蛋白及足细胞凋亡的作用目前尚不清楚。因此,本研究探讨保肾通络方含药血清对于高糖培养下足细胞Nephrin、Desmin蛋白表达及细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:10只雄性SD大鼠,平均体重(200±20)g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2014-0004。大鼠在12 h光照/黑暗循环、温度(24±1)℃、湿度50%～70%条件下饲养,并可自由进食进水。本实验通过实验动物伦理委员会批准,实验过程严格遵守动物福利伦理原则。

1.1.2 实验细胞:条件永生小鼠足细胞系,购于北纳生物科技有限公司。

1.1.3 实验试剂和药物:CCK-8试剂盒(批号C40042,碧云天生物),胱天蛋白酶3(Caspase-3)抗体(批号ab13847,Abcam),Nephrin抗体(批号ab216341,Abcam),Desmin抗体(批号ab32362,Abcam),Hochest33258染料(批号C0021,Solarbio),FITC标记的羊抗小鼠IgG(批号KGAA25,凯基生物);保肾通络方颗粒剂由首都医科大学附属北京中医医院药剂科制备。

1.1.4 实验仪器:酶标仪(型号ZS-3,北京新风机电技术公司),离心机(型号3K18,美国Sigma),倒置显微镜(型号DMIL-PH1,德国Leica),凝胶化学发光成像分析系统(型号FUSION FX6 XT,法国Vilbe),激光共聚焦显微镜(型号TCS SP8 STED,德国Leica)。

1.2 实验方法

1.2.1 保肾通络方含药血清制备:将SD大鼠随机分为空白对照组、保肾通络方含药血清组,每组5只。各组大鼠均自由饮食及饮水。保肾通络方含药血清组大鼠灌服保肾通络方1.0 g/ml(以生药量计算浓度),2 ml/次,2次/d,空白对照组灌服等量蒸馏水,连续灌胃3 d,血药浓度达峰值时,麻醉后开腹取血。分离血清后56 ℃水浴30 min,无菌滤器过滤除菌,-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 细胞分组及给药:在DMEM完全培养基中培养条件永生小鼠足细胞系,待细胞生长至80%融合时,将足细胞分为正常对照组、模型组和保肾通络方低、中、高剂量组。正常对照组足细胞予DMEM低糖培养基、24.5 mmol/L甘露醇和空白血清培养,模型组足细胞予DMEM高糖培养基和空白血清培养,保肾通络方低、中、高剂量组在予DMEM高糖培养基的基础上分别予5%、10%、15%保肾通络方含药血清培养。各组足细胞培养24 h后,对细胞进行固定或者收集,用于后续实验。

1.2.3 CCK-8检测足细胞活性:将消化好的足细胞悬液移入96孔板,保证每孔足细胞数目一致,并且细胞数目不少于1×104个。待细胞贴壁并生长状态良好时,对不同组别足细胞进行干预。然后每孔加入10 μl的CCK-8溶液,孵育后用酶标仪检测各孔OD值,并根据OD值检测各组足细胞活性。细胞活性(%)=加药细胞OD/对照细胞OD×100%。

1.2.4 免疫荧光检测足细胞蛋白表达:将消化好的足细胞悬液移入12孔板,每孔细胞数目一致。待细胞80%融合且生长状态良好,予不同干预措施。然后4%多聚甲醛固定,透膜后,予一抗4 ℃孵育过夜,后予二抗37 ℃孵育2 h,DAPI染核后封片。共聚焦显微镜观察各组足细胞Nephrin、Desmin、Caspase-3蛋白表达情况。

1.2.5 RT-PCR检测Nephrin、Desmin mRNA表达:提取各组足细胞总RNA,将mRNA反转录成cDNA,PCR仪对其进行扩增和荧光定量,采用2-ΔΔCt法对数据进行相对定量分析,实验操作完全按照说明书操作步骤进行。利用Primer 5.0软件设计引物序列,引物序列如下。Nephrin上游引物:5’-AATTGGCGGCTGGGTCTTAGGG-3’,下游引物:5’-AGGCGTGTGGGCGTGTATATGT-3’;Desmin上游引物:5’-AGACCTTCTCTGCTCTCAACTTCC-3’,下游引物:5’-CTCGCTGACAACCTCTCCATCC-3’。

1.2.6 Hochest33258染色检测足细胞凋亡:将消化好的足细胞悬液移入12孔板,每孔细胞数目一致。待细胞80%融合并生长状态良好后,予不同干预措施。4%多聚甲醛固定足细胞30 min,透膜后用Hochest33258染液染核30 min,甘油封片。共聚焦显微镜观察各组足细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD检验;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组足细胞的细胞活性比较 见表1。与正常对照组比较,模型组足细胞的细胞活性明显降低(P<0.05);与模型组比较,保肾通络方低、中、高剂量组足细胞的细胞活性不同程度升高(均P<0.05)。

表1 各组足细胞的细胞活性比较(%)

2.2 各组足细胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表达比较 见表2(图1)。与正常对照组比较,模型组足细胞Nephrin蛋白表达明显降低,Desmi、Caspase-3蛋白表达显著升高(均P<0.05);与模型组比较,保肾通络方低、中、高剂量组足细胞Nephrin蛋白表达明显升高,Desmi、Caspase-3蛋白表达显著降低(均P<0.05)。

图1 各组足细胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表达(免疫荧光染色,×400)

表2 各组足细胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表达比较

2.3 各组足细胞Nephrin、Desmi mRNA表达比较 见表3。与正常对照组比较,模型组足细胞Nephrin mRNA表达显著降低,Desmin mRNA表达水平明显升高(均P<0.05);与模型组比较,保肾通络方低、中、高剂量组足细胞Nephrin mRNA表达显著升高,Desmin mRNA表达水平明显降低(均P<0.05)。

表3 各组足细胞Nephrin、Desmi mRNA表达比较

2.4 各组足细胞凋亡细胞数目比较 见表4(图2)。与正常对照组比较,模型组足细胞凋亡数目明显升高(P<0.05);与模型组比较,保肾通络方低、中、高剂量组足细胞凋亡数目明显减少(均P<0.05)。

表4 各组足细胞凋亡细胞数目比较(个)

3 讨 论

DN是糖尿病严重的微血管并发症,也是导致ESRD重要的原发肾脏疾病[6]。与其他肾脏疾病比较,DN具有病情进展迅速的特点。蛋白尿是导致DN进展的关键病理因素[7]。肾小球滤过膜(Glomerular filtration barrier,GFB)是维持肾小球滤过功能和阻止蛋白尿产生的结构基础。GFB由内皮细胞、基底膜、足细胞三层结构组成,而足细胞是GFB中最为关键的结构[8]。足细胞又称为肾小球上皮细胞,其包裹在基底膜外侧,组成肾小球滤过膜最为重要的屏障[9-11]。高糖介导的足细胞损伤是DN蛋白尿产生及疾病进展的关键病理环节。减轻足细胞损伤可有效改善DN蛋白尿,延缓疾病进展[12]。

DN足细胞损伤主要表现为功能蛋白表达异常及足细胞凋亡。在DN中,高糖刺激会引起足细胞功能蛋白Nephrin表达下调,损伤蛋白Desmin表达上调,最终介导足细胞损伤[13-14]。Nephrin蛋白是足细胞特有的标志蛋白,同时也是非常重要的功能蛋白。Nephrin蛋白是一种跨膜蛋白,其胞外域分布在裂孔隔膜,并与相邻足细胞的Nephrin蛋白相互交叉,在裂孔隔膜上组成特殊的拉链状结构。这种特殊的拉链状结构在维持肾小球滤过功能方面起着至关重要的作用。此外,Nephrin蛋白能够介导足细胞系列信号传导,并能维持足细胞正常的细胞骨架[15]。Desmin蛋白是细胞骨架的中间丝蛋白,在正常足细胞中不表达。而在足细胞损伤时,足细胞出现表型改变,并发生骨架重排。此时足细胞开始表达Desmin蛋白,并且其表达与足细胞损伤水平呈正相关[16]。因此,Desmin蛋白是足细胞损伤的标志蛋白。

DN患者中肾小球足细胞数量明显减少[17]。高糖可介导足细胞凋亡,而足细胞凋亡会引起足细胞从肾小球基底膜上脱落,使足细胞数量及密度减少。足细胞是一种终末分化期细胞,失去了再生修复的能力。因此,足细胞凋亡是导致足细胞数量减少最为主要的原因[18-20]。足细胞凋亡病理机制十分复杂,涉及不同信号通路,其中Caspase-3蛋白是介导足细胞凋亡的关键蛋白[21]。Caspase-3位于细胞凋亡信号传导通路的中心位置,活化后直接参与切割细胞多种结构蛋白和功能蛋白,导致细胞以凋亡的形式解体,是细胞凋亡中的关键蛋白酶[22]。

中医药防治DN具有独特的优势,并显示出多靶点效应[23]。DN属于中医“水肿”“尿浊”“关格”等范畴,不同医家对其病因病机有不同的阐述。吕仁和等[24]认为DN的主要病机为痰浊瘀血积聚于肾络,而形成癥瘕,因此提出了微型癥瘕的病机理论。南征教授认为,DN后期出现的痰浊、瘀血、水湿等病理产物都属于内生之毒,因此提出毒损肾络的病机理论[25]。名中医张炳厚认为DN初期多为气阴两虚、阴虚燥热,继而出现气血凝滞,络脉闭阻,日久耗伤肾之精气,导致肾失封藏,精微下泄,因此提出“肾气精两虚,肾失封藏,肾络闭阻”是DN的核心病机,并提出补肾活血通络的治疗原则。保肾通络方即在上述治法指导下组方而成,由黄芪、熟地黄、菟丝子、刘寄奴、鬼箭羽、水蛭、丹参等药物组成。全方在补肾益气药物基础上,加用虫类药物,共奏补肾活血通络之功。临床试验已经证实,保肾通络方治疗DN临床疗效甚佳[26]。但是,保肾通络方防治DN的分子机制目前尚未阐明。

本实验观察了保肾通络方对高糖培养足细胞细胞活性的影响。结果显示,保肾通络方含药血清可提高高糖培养下足细胞细胞活性,减轻足细胞损伤,呈剂量依赖性。鉴于Nephrin、Desmin蛋白表达失调及细胞凋亡在足细胞损伤中的重要作用,本实验进一步观察保肾通络方含药血清对于高糖培养下足细胞Nephrin、Desmi表达及细胞凋亡的影响。实验结果显示,保肾通络方可以上调高糖培养下足细胞Nephrin蛋白及mRNA表达,下调Desmin蛋白及mRNA表达。足细胞损伤早期表现为蛋白表达失调,而到后期则会出现足细胞凋亡。因此,本实验对不同组别足细胞凋亡及凋亡相关蛋白Caspase-3表达情况进行观察。实验结果显示,高糖刺激可以引起Caspase-3蛋白表达上调及介导足细胞凋亡,保肾通络方含药血清可以明显下调Caspase-3蛋白表达,抑制足细胞凋亡。

综上所述,保肾通络方可以减轻DN足细胞损伤,其机制可能与其上调足细胞Nephrin蛋白、下调Desmin蛋白表达,减轻足细胞凋亡有关。