针灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠GRP78/Caspase-12/CHOP信号通路的影响

霍新慧,周知然,韦 芳,李 盼,兰永利

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830001;2.新疆维吾尔自治区中医医院消化科,新疆 乌鲁木齐 830099)

急性胃黏膜损伤(Acute gastric mucosal lesion,AGML)是指在内外部不良刺激的作用下,如颅内病变、严重外伤、大手术、休克,导致机体胃黏膜损伤,出现胃黏膜糜烂、溃疡甚至出血的急性应激性病变。近年来,胃黏膜损伤的发病率呈上升趋势。临床上通常采用药物治疗,但存在不良反应,不适合长期使用。近年来,“治未病”逐渐成为研究热点,针灸在该领域中占据着非常重要的作用[1]。本课题组前期研究已证实,针灸足三里穴、中脘穴可以加强胃黏膜微循环屏障,改善胃黏膜损伤[2]。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是炎症的特征之一,各种应激状态均可导致ERS[3]。炎症参与AGML的发生发展,葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)作为ERS的标志性蛋白,是内质网跨膜蛋白的受体分子伴侣[4]。在机体ERS时,GRP78表达上调,从而发挥保护细胞的作用。CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)是C/EBP转录因子家族中的一种重要蛋白,其在C/EBP基因中的作用是诱导细胞凋亡,所以CHOP蛋白表达水平可在一定程度反映ERS介导的细胞凋亡程度[5]。研究表明,半胱氨酸蛋白水解酶-12(Cysteine protein hydrolase-12,Caspase-12)基因表达水平在ERS诱发的凋亡过程中起着重要的促进作用,也是ERS诱导细胞凋亡的另一种信号转导途径,在内质网应激诱导的细胞凋亡途径中具有关键作用[6-7]。因此,本研究通过建立急性胃黏膜损伤动物模型,进一步研究针灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜组织病理学及GRP78/Caspase-12/CHOP信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SPF级健康大鼠52只,清洁级,雌雄各半,体重(180±20)g,由新疆医科大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证编号:SYXK(新)2018-0003。常规饲养,实验室温度(22±2)℃,相对湿度55%～60%,光照明暗交替12 H/D,自由饮食、饮水。实验过程中动物处置方式与《关于善待实验动物的指导性意见》以及相关动物伦理学要求一致。

1.1.2 实验试剂及仪器:一次性针灸针(0.25 mm×13 mm,华佗牌);特制香烟型纯艾条(4 mm×120 mm,南阳汉医艾绒公司);悬灸支架(蕲春上工记艾灸器具公司);阿司匹林肠溶片(国药准字HJ20160685,拜耳医药公司);大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA试剂盒(批号ZK-6601,上海臻科生物科技);大鼠白介素-1β(IL-1β) ELISA试剂盒(批号ZK-6601,上海臻科生物科技);大鼠环氧化酶-2(COX-2) ELISA试剂盒(批号ZK-6601,上海臻科生物科技);DAB显色液(批号2040A1012,北京中杉金桥);酶标分析仪(型号Infinite F50,上海生物科技);显微镜(型号BX51T-PHD-J11,日本奥林巴斯);切片机(型号RM2016,德国徕卡)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组与干预:52只健康大鼠在动物实验室适应性饲养7 d,然后随机分为正常组、模型组、艾灸预处理组、针刺预处理组,每组13只。正常组和模型组大鼠进行常规饲养,将大鼠自然固定于鼠板上,每次20 min,每日1次,共7 d。艾灸预处理组将大鼠仰卧位固定于鼠板上,参照《实验针灸学》[8]中常用动物(大鼠)穴位定位法选取足三里穴(双侧)、中脘穴进行艾灸治疗。操作方法:取穴后用弯剪剪去施灸点局部毛发,然后用记号笔标记穴位,将隔热贴打孔,孔径为0.5 cm,贴于选取的穴位及对照点处,艾条点燃后放置于艾灸架上,正对施灸部位,保持距离2 cm左右,3个穴位同时开始施灸,施灸温度42 ℃左右,每次艾灸20 min,每日1次,共7 d。针刺预处理组:大鼠固定方式、所选穴位、治疗时间和艾灸预处理组相同,针刺方法为指切进针法,操作者左手食指按压所刺腧穴位置旁边部位,用右手持针,紧靠左手指甲面快速进针,间隔5 min进行提插捻转。每次均由同一人对大鼠进行操作。

1.2.2 模型的建立:参照课题组前期实验制备AGML模型[9]。第7天艾灸预处理结束后,四组大鼠禁食不禁水24 h,第9天开始对各组大鼠进行无水乙醇联合阿司匹林混悬液灌胃,建立AGML模型。按0.6 ml/100 g的剂量用灌胃针头将无水乙醇注入模型组、艾灸预处理组、针刺预处理组大鼠胃内,1 h后再将200 mg/kg阿司匹林混悬液0.1 ml/100 g注入大鼠胃内,连续造模7 d。

1.2.3 取材:造模结束后,各组大鼠禁食24 h,禁水8 h,用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉,麻醉满意后,暴露腹腔,取腹主动脉血,常温静置后,离心机离心取上清液,检测相关因子水平。将大鼠全胃取出,用冰0.9%氯化钠溶液冲洗,肉眼观察胃黏膜损伤情况,苏木素-伊红(HE)染色观察其组织病理学改变。

1.3 观察指标

1.3.1 —般情况:每日定时观察各组大鼠毛发光泽、饮食水量、大小便、精神状态及活动情况,定期监测大鼠体重。

1.3.2 胃黏膜损伤指数(UI):按GUTH法计算评定UI[10]。损伤长度≤1 mm为1分;1 mm<损伤长度≤2 mm为2 分;2 mm<损伤长度≤3 mm为3分;3 mm<损伤长度≤4 mm为4分;损伤长度>4 mm为5分;损伤宽度>2 mm者计分加倍。每只大鼠的UI为各分值累计相加。

1.3.3 AGML大鼠组织病理学观察:取1.0 cm×0.5 cm大小的胃黏膜组织,4%多聚甲醛固定标本、脱水、石蜡包埋、切片,HE染色后光镜下观察大鼠胃黏膜组织病理形态。

1.3.4 ELISA检测血清炎症因子水平:将大鼠血液标本常温静置10～15 min,4 ℃,3000 r/min离心20 min,提取上清液置于EP管中,-80 ℃冰箱保存待检。ELISA法检测胃黏膜损伤大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平。实验过程严格按照ELISA试剂盒说明书执行。

1.3.5 免疫组化法检测大鼠胃黏膜组织GRP78/Caspase-12/CHOP通路蛋白表达:检测过程中严格遵照试剂盒说明书操作,常规石蜡包埋、组织切片经抗原修复后,滴加正常山羊血清液室温封闭,滴加一抗工作液,4 ℃过夜,PBS洗涤3次后,滴加生物素化第二抗体、辣根酶标记链霉卵白素工作液,DAB显色,复染,常规树脂封片,镜下观察。

1.4 统计学方法 本研究采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计数资料用均数±标准差表示,组间方差齐时采用单因素方差分析;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 在造模前、艾灸预处理及针刺预处理期间,四组大鼠毛发光泽,饮食水量、大小便、精神等一般状态均正常,体重增加。在造模后,与正常组大鼠比较,模型组大鼠毛发无光泽,饮食水量减少,大便稀溏,精神不振,蜷缩懒动,状态差,体重下降(P<0.05);与模型组比较,艾灸预处理组、针刺预处理组大鼠一般情况有明显改善,体重增加(均P<0.05),且艾灸预处理组较针刺预处理组大鼠体重改善更明显(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体重比较(g)

2.2 各组大鼠UI评分比较 见表2(图1)。正常组大鼠胃黏膜光滑完整;模型组大鼠胃黏膜可见斑点状破溃出血灶,UI评分显著高于正常组(P<0.05);艾灸预处理、针刺预处理组大鼠胃黏膜仅见少量斑点状出血点,UI评分明显低于模型组(均P<0.05);与针刺预处理组比较,艾灸预处理组大鼠UI评分显著降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠UI评分比较(分)

2.3 各组大鼠胃黏膜组织病理学观察 光镜下,正常组大鼠胃黏膜表面上皮结构清晰完好,细胞排列整齐有序,未发现充血、红染、脱落等炎性细胞浸润现象。模型组大鼠胃黏膜上皮细胞结构破坏,结构不完整,细胞分布错乱无序,细胞内可见明显充血,表现出红染的征象,出现炎症细胞浸润,胃黏膜组织损伤明显。针刺、艾灸预处理组大鼠胃黏膜损伤征象明显减轻,胃黏膜结构比较清晰,细胞部分有脱落,细胞内充血、红染等病理征象明显改善,炎症细胞浸润较少,且艾灸预处理组大鼠胃黏膜损伤减轻更明显,可见新生的肉芽组织。见图2。

图2 各组大鼠胃黏膜组织病理学改变(HE染色,×400)

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平比较 见表3。与正常组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平显著升高(均P<0.05)。与模型组比较,艾灸预处理组、针刺预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平显著降低(均P<0.05),且艾灸预处理组降低更明显(均P<0.05)。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、COX-2水平比较

2.5 各组大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP表达情况比较 与正常组比较,模型组GRP78、Caspase-12、CHOP呈强阳性表达,细胞内充满大量棕黄色颗粒;与模型组比较,针刺、艾灸预处理组大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP结果阳性细胞数量减少,细胞内棕黄色颗粒减少,表达减弱,呈弱阳性,艾灸预处理组减少更明显。见图3。

图3 各组大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP水平比较(免疫组化染色,×200)

3 讨 论

现代医学研究认为,AGML是临床常见的急症,而炎症反应是胃黏膜损伤难以改善和易反复发作的主要原因[11]。炎性因子TNF-α、IL-6是炎症反应的重要标志物,可用于评价胃黏膜损伤的炎症反应程度[12-13]。TNF-α、IL-6与胃黏膜损伤密切相关,TNF-α不仅能活化炎性细胞,加重炎症反应,还是导致溃疡愈合困难、反复发作的重要原因[14]。COX-2是消化道疾病发生发展的危险因素[15],也是引起炎症反应的关键因素之一,在正常组织细胞中或者炎症反应程度较低的组织中,COX-2含量极低或不表达;但当细胞受到炎症等刺激时,其在炎症细胞中会迅速合成并释放,含量可升高至正常水平的10～80倍[16],导致炎症反应和组织损伤。且有研究发现,COX-2水平在胃溃疡组织中呈高表达,通过抑制COX-2可减少胃酸分泌,促进胃溃疡愈合,减少复发[17-19]。胃黏膜在受到一定程度损伤后,可激活机体修复功能,其机制主要通过损伤后的上皮细胞增生来实现,多种保护因子参与了胃黏膜的细胞增殖修复过程,从而提高了胃黏膜的保护及防御功能,促进胃黏膜修复,避免损伤向深层发展[20-21];而应激状态下,胃黏膜细胞糜烂充血导致表面上皮细胞再修复能力下降,促进炎症因子TNF-α、IL-6、COX-2分泌,降低了黏膜自身的防御修复作用[22]。

研究表明,针灸预处理对胃黏膜具有一定的保护作用[23]。如明代高武在《针灸聚英》中首次提出“逆针灸”,即在疾病尚未发生时采用针灸治疗,能扶助正气,防止疾病发生。艾灸作为中医的一种外治疗法,对胃脘系疾病具有比较好的预防及治疗作用[24]。在机体尚未发病时,通过艾灸对某些腧穴进行温热刺激,以激发人体经脉之气,提高身体抵抗力和应变能力,降低免疫细胞对炎症的反应,促进炎症消除和组织的恢复,从而达到预防和治疗的目的[25-26]。大量临床和实验研究结果也表明,艾灸能启动抗炎、抑制凋亡、促修复等一系列抗胃黏膜损伤效应[27-28]。

胃黏膜损伤性疾病根据其临床表现和特点可归属于中医“胃脘痛”范畴。足阳明胃经与胃腑疾病有着密切的关系。足三里穴为足阳明胃经的合穴及胃之下合穴,具有益气养血、调节胃肠功能、提高免疫力的作用[29-30]。故治疗胃脘部疾病可首选足三里穴。历代文献对足三里穴的主治记载甚广,曾有“三里功多数不清”之说。《针灸大全》云:“能通心腹胀,善治胃中寒,肠鸣并泄泻”,《灵枢》中指出:“合治内府”,《养生类纂》说:“三里,五脏六腑也,沟渠也,常欲宣通,即无风疾”等,均可以采用针灸足三里穴治疗胃脘部疾病。中脘穴位于任脉上,在心蔽骨与脐连线的正中,是足阳明胃经的募穴,特定穴中八会穴的腑会,也是手太阳经、手少阳经、足阳明经、任脉之会。中脘穴位于胃的中部,是养胃的重要穴位,具有疏肝养胃、和胃降逆、健脾利湿之效,主治一切腑病,尤胃腑优先[31-32]。足三里穴与中脘穴之配伍,属于“合募配穴”,合用擅长治疗胃病,调理胃腑。故本实验选取了“足三里”“中脘”两个穴位,均能治疗胃部疾病,联合使用效果更好。

本研究结果所示,无水乙醇结合阿司匹林混悬液灌胃建立大鼠AGML模型,模型组大鼠出现饮食水量减少,精神活动等一般状态不佳,体重下降。HE染色结果可见大鼠胃黏膜上皮细胞结构破坏、充血、炎症细胞浸润、胃黏膜组织损伤明显等病理征象,血清中促炎性细胞因子浓度升高。预先给予艾灸、针刺足三里和中脘穴的大鼠,促炎因子浓度低于模型组,可明显减轻大鼠胃黏膜损伤,上皮细胞表面部分脱落,细胞内充血明显改善,炎症细胞浸润较少,胃黏膜结构比较清晰,且作用较针刺预处理明显。这可能与针灸能调节和恢复胃肠功能、增强自身防御、抑制ERS、降低炎性因子有关。

GRP78、Caspase-12、CHOP作为ESR的标志物,能释放大量促炎因子,AGML在应激状态下能使GRP78、Caspase-12、CHOP阳性细胞增加,从而启动细胞凋亡通路。本研究采用免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜组织,结果可见模型组GRP78、Caspase-12、CHOP细胞表达呈强阳性,针刺、艾灸预处理组大鼠GRP78、Caspase-12、CHOP表达减弱,艾灸预处理组减少更明显,提示针灸能减轻大鼠胃黏膜炎症反应,抑制血清中促炎因子水平,释放抗炎因子,促进胃黏膜损伤修复愈合,发挥胃黏膜保护作用。

综上所述,针灸预处理可减轻AGML大鼠炎症反应,其作用机制可能是通过抑制ERS,基于GRP78/Caspase-12/CHOP信号通路预防大鼠胃黏膜损伤。