顶空气相色谱-质谱法测定茶叶中溴甲烷

罗春连

（福建省工业产品生产许可证审查技术中心,福州 350003）

种茶、制茶和饮茶文化都起源于中国,千百年来,茶叶借由茶马古道和海陆丝绸之路由中国传播至世界各地,备受世界人民喜爱[1-2]。中国茶叶流通协会在《2021年中国茶叶产销形势报告》中指出,我国茶树种植面积为4 896.09 万亩,干毛茶总产量306.32万吨,产值2 928.14亿元,茶树种植面积和茶叶市场消费规模庞大,相比于往年均有所增加[3]。茶叶产销规模取决于茶叶品质[4],但茶叶在种植和储藏过程中易受病虫害的影响[5-7]。

溴甲烷是一种广谱性熏蒸剂,对病菌[8]、昆虫[9]、线虫[10]、杂草[11]等病害生物的防治效果尤为显著,也被用于茶叶的消毒[12]。但溴甲烷的使用不仅会破坏土壤微生态平衡,还会损耗臭氧层,上世纪末《蒙特利尔议定书》哥本哈根修正案就建议各缔约国中发达国家和发展中国家分别于2005 年和2015 年将其淘汰[13]。然而联合国溴甲烷技术选择委员会（Methyl Bromide Technical Options Committee,MBTOC）在对20 余种溴甲烷替代物进行评估后发现,溴甲烷的广谱性消毒优势使其难以完全被替代,因此在一些必要用途上仍需申请豁免使用[14-16]。溴甲烷对农田或农产品的熏蒸可能会形成残留,而溴甲烷无色无味难以引起警戒[17],对人体的肺、肾、肝等脏器及神经系统和心血管系统造成潜在危害[18],因此溴甲烷残留量的检测和控制尤为重要。

当前溴甲烷的检测方法有离子迁移谱法[19]、酸回流-毛细管色谱法[20]、吹扫-捕集-气相色谱法[21]等,这些检测方法对于茶叶中溴甲烷的检测不够便捷,且未使用质谱等定性确证工具,尚缺茶叶中溴甲烷检测的国家标准或行业标准。溴甲烷是茶叶农残中重点关注的物质,英国对茶叶中溴甲烷残留限量为0.05 mg/kg,我国GB 2763—2021 规定其临时残留限量为0.02 mg/kg,因此建立茶叶中溴甲烷的便捷、准确、灵敏的检测方法至关重要。气相色谱-质谱（GC-MS）法能够对未知样品中易挥发的物质进行定性定量检测,结合溴甲烷不溶于水、熔点低、易挥发等理化特性,采用顶空GC-MS 法检测茶叶中溴甲烷残留量,能够为茶叶中溴甲烷的检验和监管提供技术支持,促进茶叶产业的健康发展。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

分析天平：ME203E 型,美国梅特勒-托利多集团。

气相色谱-质谱联用仪：GCMS-QP2020 型,日本岛津公司。

顶空进样器：HS-20型,日本岛津公司。

多功能粉碎机：WJX-A500型,上海缘沃工贸有限公司。

溴甲烷：色谱纯,天津阿尔塔科技有限公司。

甲醇：色谱纯,德国默克集团。

氯化钠：质量分数为99.8%,国药集团化学试剂有限公司。

饱和氯化钠溶液：准确称取36.00 g 氯化钠于250 mL烧杯中,加入100 mL去离子水,于磁力搅拌器中常温搅拌至溶解。

溴甲烷标准贮备液：100 μg/mL,准确称取0.010 0 g溴甲烷,加入甲醇稀释至100 mL。

氦气：体积分数不小于99.999%,福州新航工业气体有限公司。

茶叶样品：分别为白茶、绿茶、乌龙茶和红茶,来自福建宁德、福州、泉州和南平四地茶叶产区。

实验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 顶空进样器

转换阀温度：50 ℃；传输线温度：65 ℃；平衡时间：30 min。

1.2.2 气相色谱仪

色谱柱：DB-5MS 石英毛细管柱[30 m×0.25 mm,0.25 μm,安捷伦科技(中国)有限公司]；进样口温度：220 ℃；离子源温度：300 ℃；接口温度：300 ℃；柱温：50 ℃,保持3 min；进样方式：分流进样,分流比为100∶1；载气：氦气,流量为0.80 mL/min；进样体积：100 μL。

1.2.3 质谱仪

离子源：电喷雾离子源(ESI),正离子模式；扫描方式：选择反应监测（SRM）；溴甲烷SIM监测离子：m/z94,96（定量离子为m/z94）。

1.3 实验步骤

1.3.1 溴甲烷的提取

参照GB/T 8303—2013,将茶叶样品研磨粉碎,过30 目筛（孔径600 μm）,制备成茶粉。分别称取2.50 g 茶粉于20 mL 顶空瓶中,加入5 mL 的饱和氯化钠溶液,立即旋盖密封（瓶盖中心为聚四氟乙烯薄膜,便于扎入进样针）,置于顶空装置中,于40 ℃保温30 min,抽取100 μL上部气体进行GC-MS检测。

1.3.2 溴甲烷标准曲线的绘制

取100 μg/mL 溴甲烷标准贮备液适量,用甲醇分别稀释至0、2.5、5、10、20、40 μg/mL,制备成系列溴甲烷标准溶液。分别在含有5.0 mL 饱和氯化钠溶液的顶空瓶中加入10 μL不同浓度的溴甲烷标准溶液,于40 ℃保温30 min,抽取100 μL上部气体进行GC-MS检测,以溴甲烷质量为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归,得标准曲线线性方程和相关系数。

1.3.3 定量方法

采用外标法进行定量。在1.3.2 绘制标准曲线的基础上,将待测茶叶样品按照1.3.1的方法研磨成粉并经过顶空提取之后进行GC-MS 检测,以定量离子m/z94 为SIM 监测指标,将相同保留时间的目标峰的峰面积带入标准曲线进行溴甲烷质量换算。每种待测茶叶样品平行测定6 次,取平均值作为测定值。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离条件的选择

气相色谱柱作为固定相,对同一样品中的不同物质具有不同的吸附和解离能力,其型号对目标物质的分离度和保留时间影响较大。溴甲烷的极性较弱,不溶于水而易溶于有机溶剂,弱极性的DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）对溴甲烷的分离效果优于强极性的DB-WAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.5 μm）。气相色谱柱的初始温度为50 ℃,高于溴甲烷的沸点4 ℃,在该温度运行模式下,溴甲烷的保留时间为1.65 min,因此无需设置升温程序,可按50 ℃恒温运行。对比不同分流比对溴甲烷分离的影响,分流比200∶1时,溴甲烷的响应信号较低；分流比为100∶1时,溴甲烷的响应信号与分离度均较好；分流比50∶1时,溴甲烷的分离度较差,因此确定最佳分流比为100∶1。

2.2 溴甲烷顶空提取条件优化

在进行目标物的顶空提取时,饱和氯化钠溶液是常用的提取溶剂,其化学惰性能够避免顶空提取过程中的基质效应[22],还能发挥盐析作用改变目标物在顶空瓶内的分配系数,从而提高检测灵敏度[23]。分别在茶叶基质中添加不同浓度的溴甲烷,比较不同饱和氯化钠溶液体积对溴甲烷提取的影响,当溴甲烷添加质量分数分别为0.02、0.04、0.20 mg/kg时,分别使用2.5、5.0 mL 饱和氯化钠溶液进行提取,对应的色谱峰面积如图1 所示。结果表明,较大体积的饱和氯化钠溶液有助于提高溴甲烷的检测灵敏度,当茶叶基质中溴甲烷含量越高时,盐析作用越明显,使用5.0 mL的饱和氯化钠溶液相比于2.5 mL的峰面积差值大,这是由于溴甲烷沸点（4 ℃）低且不溶于水,在顶空瓶体系中易受热挥发,饱和氯化钠的盐析作用降低了溴甲烷在水中的溶解度,当饱和氯化钠体积增加时,进一步压缩了顶空瓶中的气体体积,从而起到浓缩作用,当茶叶基质中溴甲烷浓度越高时,其浓缩效果越明显,仪器检测的响应值越大。因此选定饱和氯化钠溶液的添加体积为5.0 mL。

图1 不同饱和氯化钠溶液的体积对应的茶叶基质中不同浓度溴甲烷的色谱峰面积

2.3 线性关系

按照1.3.2绘制标准曲线,得溴甲烷线性方程为y=7.357 3x-18.012,相关系数为r=0.999 7,表明线性良好,该GC-MS 检测方法适用于溴甲烷的检测。由于不同重复批次中目标物质在顶空提取过程中固-液、气-液的分配比存在微小差异,高浓度样品的检测偏差会被放大,因此当样品中溴甲烷质量大于200 ng时,存在一定的检测偏差,但这种偏差影响较小,依然可以保证溴甲烷测定值的准确度,故溴甲烷线性范围确定为0～400 ng。

2.4 方法检出限和定量限

茶叶样品基质组分复杂,可能会对溴甲烷的检测造成干扰,样品背景干扰越小,溴甲烷的检出限和定量限越低。在顶空提取的条件下,茶叶空白基质中主要干扰物质为挥发性风味物质[24],这些挥发性风味物质有数十种乃至上百种[25-26],容易对目标物造成检测干扰,而GC-MS 的SIM 监测模式可对目标质荷比（m/z）的离子进行监测扫描,从而排除其它离子的干扰。分别在2.50 g不同茶叶空白基质中添加10 μL 的5 μg/mL 溴甲烷标准溶液,再加入5.0 mL饱和氯化钠溶液进行顶空提取和GC-MS检测,由白茶（图2）、绿茶（图3）、乌龙茶（图4）和红茶（图5）的空白基质及其加标样品的SIM色谱图可知,不同茶叶空白基质对溴甲烷目标峰干扰较小,表明该法可用于白茶、绿茶、乌龙茶和红茶中溴甲烷的分离检测。

图2 白茶空白基质（A）与其加标样品（B）的SIM色谱图

图3 绿茶空白基质（A）与其加标样品（B）的SIM色谱图

图4 乌龙茶空白基质（A）与其加标样品（B）的SIM色谱图

图5 红茶空白基质（A）与其加标样品（B）的SIM色谱图

分别在2.50 g 不同茶叶空白基质中添加10 μL的5 μg/mL 溴甲烷标准溶液,再加入5.0 mL 饱和氯化钠溶液进行顶空提取和GC-MS 检测,以溴甲烷目标峰的信噪比（S/N）≥3 为检出限,信噪比（S/N）≥10为定量限。计算得上述4种茶叶基质存在的条件下溴甲烷目标峰的信噪比（S/N）分别为13.2、15.2、12.1、15.3,确定该方法的定量限（S/N≥10）为0.02 mg/kg,换算得方法检出限（S/N≥3）为0.006 mg/kg。GB 2763—2021规定茶叶中溴甲烷的临时残留限量为0.02 mg/kg,该方法的检测灵敏度能够满足国标限量检测需求。

2.5 方法精密度和准确度

分别在2.50 g 不同茶叶空白基质中添加1.0、2.0、10.0倍定量限（0.02 mg/kg）的溴甲烷标准溶液,测定体系中溴甲烷的含量并计算加标回收率及变异系数（CV）,每种样品每个加标水平平行测定6 次,取平均值作为测定值,结果见表1。由表1 可知,不同茶叶样品中溴甲烷的加标回收率为91.97%～105.33%,变异系数不大于10.77%。国标GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求目标物质量分数在0.01～0.1 mg/kg时,回收率应为60%～120%,变异系数要小于21%；目标物浓度在0.1～1 mg/kg 时,回收率为80%～110%,变异系数要小于15%。结果表明,该方法的回收率和精密度均符合国标要求,方法具有可行性。

表1 不同茶叶空白基质中溴甲烷加标回收试验结果（n=6）

3 结语

在优化提取方法的基础上建立了不同茶叶中溴甲烷的顶空GC-MS 检测法,该法满足GB/T 27404—2008相关要求,灵敏度和准确度高,重现性好,可为茶叶中溴甲烷残留的检测和监管提供技术支持,有利于茶叶产业的健康发展。