miR-145-5p 在正常大鼠与2 型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的表达比较

戴雅文，鄂玲玲，郑 颖，马小草，张 戎，时 权，刘洪臣解放军总医院研究生院，北京 00853；解放军总医院第一医学中心口腔医学研究所、口腔颌面战创伤军队重点实验室，北京 00853

全球超过5 亿人患有糖尿病，其中2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)约占90%[1]。T2DM 可引起一系列并发症，除视网膜病变、心血管疾病、肾病、神经病变等疾病外，还会导致骨丢失和骨质疏松，影响骨愈合，增加骨折的风险。随着糖尿病患者数量增加，糖尿病导致的骨代谢疾病成为全球重要的疾病负担[2-4]。有证据表明，糖尿病微环境可影响糖尿病骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)而导致机体骨代谢失衡，但其具体机制尚不清楚[5-6]。

微RNA (microRNA，miRNA) 是一类短的非编码RNA，通过靶向靶基因调控蛋白表达参与细胞增殖、凋亡、迁移等多种生物学过程，与骨代谢和骨稳态密切相关[7]。miR-145-5p 靶向SOX9 抑制正常人脂肪间充质干细胞增殖及成软骨分化[8]；靶向Smad4 可降低Sox-9、Col-2A1、聚集蛋白聚糖的表达，抑制骨关节炎患者源骨髓间充质干细胞的增殖和成软骨分化[9]。miR-145-5p 还可靶向SEMA3A 降低Wnt 通路基因Wnt3a、Wnt10a 的表达，抑制2 型糖尿病大鼠脂肪间充质干细胞成骨分化[10]。然而，miR-145-5p 对2 型糖尿病股骨BMMSCs 成骨分化的影响尚不清楚。本研究比较正常大鼠与2 型糖尿病大鼠股骨BMMSCs 的增殖和成骨分化能力，初步探讨正常大鼠与2 型糖尿病大鼠股骨BMMSCs 成骨分化中miR-145-5p、SEMA3A、β-catenin 表达的差异，为进一步研究miRNA-145-5p 在糖尿病环境下影响骨代谢的分子机制提供依据。

材料与方法

1 实验动物 8 周龄SPF 级雄性Wistar 大鼠(共12 只) 购于维通利华有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2021-0011。8 周龄雄性GK 大鼠(共12只)购于常州卡文斯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。动物实验经解放军总医院实验动物伦理委员会审核并予以批准(2021-X17-90)。

2 主要试剂和仪器 罗氏Accu-Check Active 活力型血糖仪(Roche，瑞士)，低糖DMEM (Gibco，美国)，胎牛血清(Gibco，美国)，CCK-8 试剂盒(日本同仁，日本)，结晶紫染色液(碧云天，中国)，抗坏血酸(Sigma，美国)，β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)，地塞米松(Sigma，美国)，茜素红S 染色液(Sigma，美国)，OriCell®间充质干细胞(大鼠)表面标记检测试剂盒(Cyagen, 中国)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 染色液(偶氮偶联法) (Solarbio，中国)，ALP 检测试剂盒(碧云天，中国)，Western blot 及IP 细胞裂解液(无抑制剂) (碧云天，中国)，BCA 蛋白定量试剂盒(Solarbio，中国)，RNA 提取液(Servicebio，中国)，ECL 化学发光试剂盒(Servicebio，中国)，荧光定量PCR 仪(Bio-Rad，美国)。

3 2 型糖尿病大鼠模型建立 高脂高糖饲料喂养GK 大鼠(12 只) 构建2 型糖尿病大鼠模型，作为实验组；普通饲料喂养Wistar 大鼠(共12 只)作为对照组。8 ~ 13 周每周于固定时间测定体质量、大鼠尾静脉采血进行随机血糖检测。2 次随机血糖浓度≥16.7 mmol/L 视为2 型糖尿病模型造模成功[11]。

4 股骨BMMSCs 原代培养及传代 取正常Wistar大鼠和造模成功的GK 大鼠各12 只，腹腔注射过量戊巴比妥钠处死，分离出双侧股骨，用咬骨钳去除股骨两端，暴露骨髓腔，用5 mL 注射器吸取普通培养液(含10% 胎牛血清和1% 青链霉素的DMEM 培养液)冲洗骨髓腔，收集冲洗液于100 mm大皿中，细胞孵育箱内培养(37 ℃，5% CO2)。当细胞密度达80%融合时进行传代培养，使用第3 代Wistar 大鼠BMMSCs (WT-BMMSCs)和GK 大鼠BMMSCs (GK-BMMSCs)进行后续的实验[12]。

5 干细胞表型检测 取第3 代WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs，PBS 洗2 次，0.25% 胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心5 min，弃去上清液。各管加入流式细胞缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为3 ×106/mL。取100 µL 细胞悬液放入1.5 mL EP 管，每管加入2 µL 一抗CD90、CD44、CD34、CD45、CD11b/c 混匀。4℃孵育30 min，用200 µL 流式缓冲液清洗细胞2 次。250 g 离心5 min，弃上清。每管加入100 µL 流式细胞缓冲液，加入二抗，重悬细胞。4℃孵育30 min，用200 µL 流式缓冲液清洗细胞2 次。250 g 离心5 min，弃上清。用300 µL 流式细胞缓冲液重悬细胞后流式细胞仪分析。

6 CCK-8 检测细胞生长 取第3 代WT-BMMSCs和GK-BMMSCs， 以2 × 103/孔的密度接种于96孔板(普通培养液)，每组样本量为6。培养的1 ~9 d，每孔加入10 µL CCK-8 工作液，37℃孵箱孵育2 h 后，于450 nm 处检测两组细胞的吸光度值，连续检测9 d，绘制细胞生长曲线。实验重复3 次。

7 细胞集落形成实验 取第3 代WT-BMMSCs和GK-BMMSCs，胰酶消化后重悬并进行细胞计数。以1 × 102/孔的密度接种于六孔板(普通培养液)，每组样本量为6。常规培养10 d，弃去原培养液，4% 多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色5 min，PBS 清洗3 遍，拍照。计数每孔的集落数，计算集落形成率。实验重复3 次。

8 成骨诱导实验 实验分为WT-BMMSCs、GKBMMSCs、WT-BMMSCs + 成骨诱导液(osteogenic differentiation medium，OM)和GK-BMMSCs + OM四组。以2 × 105/孔的密度接种于六孔板(普通培养液)，每组样本量为6。常规培养至细胞达70%融合后分别更换为普通培养液和成骨诱导液(含10%胎牛血清、1% 青链霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 µg/mL 抗坏血酸和1 × 10-4mmol /L 地塞米松液的DMEM 培养液) 继续培养。每3 d 换液1 次。

9 ALP 染色及半定量分析 成骨诱导7 d 后弃去诱导液，PBS 洗涤3 次，4% 多聚甲醛固定30 min，配置BCIP/NBT 染色工作液，每孔加入1 mL，室温避光孵育15 min，PBS 洗涤2 次后拍照。半定量分析：弃去原培养液，PBS 清洗2 次，每孔加入100 µL 细胞裂解液充分裂解细胞，收集裂解液于EP 管中，4℃下12000 r/min离心30 min，取上清。BCA 法测定蛋白浓度，将样品稀释为50 µg/50 µL。每孔吸取50 µL 加入96 孔板中，同时设置空白对照组和标准品组，每组设5 个复孔。加入50 µL 显色液，37℃孵育10 min，每孔加入100 µL 终止液终止反应，酶标仪于405 nm 处测定吸光度值，根据标准曲线计算ALP 表达量[13]。实验重复3 次。

10 茜素红染色观察钙化结节 成骨诱导21 d后，PBS 清洗1 次，4% 多聚甲醛固定30 min，1%茜素红染色液染色5 min，PBS 清洗后拍照。

11 实 时 定 量PCR 检 测miR-145-5p、SEMA3A、成骨相关基因和成骨通路关键蛋白的mRNA表达 实验分为WT-BMMSCs、GK-BMMSCs、WT-BMMSCs + OM 和 GK-BMMSCs + OM 四组，将细胞以2 × 105/孔的密度接种于六孔板中培养于普通培养液，每组样本量为3，待细胞达70%融合后分别更换为普通培养液和成骨诱导液继续培养7 d。每孔加入1 mL Trizol，提取细胞总RNA，使用超微量分光光度计测定RNA 浓度及纯度。逆转录合成cDNA 共20 µL 反应体系：5 ×Reaction Buffer 4 µL；Gene-specific primer 2 µL；Servicebio®RT Enzyme Mix 1 µL； RNA 10 µL；RNase free water 3 µL，程 序 设 置 为25℃变 性5 min；42℃退火30 min；85℃延伸5 s。然后配置以下反应体系：2 × qPCR Mix 7.5 µL；基因引物(上游 + 下游) 1.5 µL；cDNA 2 µL；Water Nuclease-Free 4 µL，按 照 以 下 条 件 进行PCR 扩增：95℃预变性30 s；95℃变性15 s；60℃延伸30 s，进行40 个循环，荧光定量PCR 检测各组细胞中miR-145-5p、SEMA3A，成骨相关基因COL-1、RUNX2、ALP、OCN 和成骨通路关键蛋白β-catenin 的mRNA 表达水平。引物信息见表1。ΔΔCT 法处理结果，实验重复3 次，取平均值。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

12 Western blot 检 测SEMA3A 和 成 骨 相 关 基因的蛋白表达 实验分为WT-BMMSCs、GKBMMSCs、WT-BMMSCs + OM 和GK-BMMSCs +OM 四组，将细胞以2 × 105/孔的密度接种于六孔板中培养于普通培养液，每组样本量为3，待细胞达70%融合后分别更换为普通培养液和成骨诱导液继续培养7 d。培养结束后用PBS 清洗2 遍，每孔加入RIPA 裂解液200 µL，冰上裂解5 min，4℃下12000 r/min 离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液。BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备5% SDS-PAGE 凝胶电泳进行蛋白分离，PVDF 转膜，室温下5% 脱脂牛奶封闭30 min，加入一抗(一抗稀释比：Actin 1∶2000；ALP 1∶300； OCN 1∶300； RUNX2 1∶300；SEMA3A 1∶300) 4℃孵 育 过 夜；次 日TBST 洗3 次，每次5 min，加入二抗(二抗稀释比 1∶500)室温孵育30 min 后，TBST 洗3 次，ECL 发光液显影检测。使用Adobe 软件对Western blot 条带进行分析。实验重复3 次。

13 统 计 学 分 析 统 计 学 分 析 使 用Graphpad Prism 8 软件进行，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，Tukey 多重比较检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 2 型糖尿病大鼠造模成功 通过4 周高脂高糖饲料的喂养，GK 大鼠出现血糖上升及多饮、多食、多尿现象。12 周时GK 大鼠的体质量显著低于Wistar 大鼠(P＜0.001；图1)，同时血糖显著高于Wistar 大鼠并维持稳定(P＜0.001；图2)。连续两次检测随机血糖≥16.7 mmol/L，GK 大鼠2 型糖尿病模型造模成功。

图1 8 ~ 13 周Wistar 与GK 大鼠体质量(n=12；aP＜0.001，vsGK)Fig.1 Changes in body weight of Wistar and GK rats from 8 to 13weeks (n=12; aP＜0.001, vsGK)

图2 8 ~ 13 周Wistar 与GK 大鼠血糖(n=12；aP＜0.001，vsGK)Fig.2 Changes in blood glucose of Wistar and GK rats feom 8 to 13weeks (n=12; aP＜0.001, vsGK)

2 股骨BMMSCs 分离培养及干细胞表型检测镜下见原代细胞呈长梭形或多角形，贴壁生长，夹杂着圆形高亮未贴壁的杂细胞，原代细胞培养6 ~ 8 d 可达融合，传代后细胞2 ~ 4 d 可达融合(图3)。流式细胞术进行干细胞表型检测，结果显示，体外培养的WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs均阳性表达大鼠间充质干细胞表面标志物CD90(97.5%/99.6%) 、CD44 (98.8%/97.9%)，阴性表达造血 干细 胞 标 志 物CD34 (1.49%/2.47%)、CD45(1.13%/1.55%)、CD11b/c (1.51%/1.87%)。符 合 干细胞分子表型(图4)。

图3 倒置显微镜观察原代(P0)与第3 代(P3)正常和糖尿病大鼠BMMSCs (标尺=100 µm)Fig.3 Primary and the third generation BMMSCs derived fromnormal and type 2 diabetic rats (scale bar=100 µm)

图4 流式细胞学鉴定BMMSCs 表面抗原F ig.4 Identification of BMMSCs surface antigens by flow cytometry

3 WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 的生物学特性比较

3.1 细胞生长曲线 CCK-8 结果显示，两组细胞的生长曲线均呈现出生长潜伏期、对数生长期和平台期，从4 d 开始，WT-BMMSCs 的增殖速率显著高于GK-BMMSCs (P＜0.01；图5)。

图5 CCK-8 试剂盒检测正常和糖尿病大鼠股骨BMMSCs 生长曲线(n=6；aP＜0.01，vsGK)Fig.5 Detection of growth curve of BMMSCs derived from normaland type 2 diabetic rats by CCK-8 kit (n=6; aP＜0.01, vsGK)

3.2 集落形成能力 结晶紫染色结果显示，WTBMMSCs 和GK-BMMSCs 培养10 d 时均有细胞集落形成，WT-BMMSCs 集落形成率显著高于GKBMMSCs (P＜0.01；图6)。

图6 正常和糖尿病大鼠股骨BMMSCs 集落形成实验A：结晶紫染色检测正常和糖尿病大鼠10 d 时股骨BMMSCs 集落形成能力(标尺=100 µm)；B：正常和糖尿病大鼠股骨BMMSCs 集落形成率(n=6)Fig.6 Colony formation experiment of femoral BMMSCs in normal rats and type 2 diabetic rats A: Crystal violet staining were performed on day 10 (scale bar=100 µm); B: Colony forming efficiency of the two group (n=6)

3.3 成骨分化能力 成骨诱导7 d 后ALP 染色结果表明，WT-BMMSCs 染色较GK-BMMSCs 深，ALP 半定量检测结果与染色结果一致(P＜0.001；图7A、图7B)。成骨诱导21 d 后茜素红染色结果显示，正常组和GK-BMMSCs 均出现大小不等的钙化结节，WT-BMMSCs 染色较GK-BMMSCs深(图7C)。

图7 正常与2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化能力比较A：成骨诱导7 d 碱性磷酸酶染色(标尺=100 µm)；B：成骨诱导7 d ALP 半定量分析 (n=6)；C：成骨诱导21 d 茜素红染色显示钙化结节形成(标尺=100 µm)Fig.7 Comparison of osteogenic differentiation capacity of BMMSCs derived from normal rats and type 2 diabetic rats A: ALP staining was performed on day 7 after osteogenic differentiation (scale bar=100µm); B: Quantification of ALP activity was shown (n=6); C: ARS staining was performed on day 21 after osteogenic differentiation to show the formation of calcified nodules(scale bar=100µm)

4 WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨分化相关基因的表达 qRT-PCR 结果显示，成骨诱导7 d时WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨诱导组成骨分化相关基因ALP、OCN、RUNX2、COL1 的表达均显著高于未诱导组(P＜0.05)，而GK-BMMSCs成骨诱导组的表达显著低于WT-BMMSCs 成骨诱导组(P＜0.01；图8)。Western blot 结果显示，WTBMMSCs 诱导组成骨基因ALP、OCN 表达均显著高于未诱导组，GK-BMMSCs 成骨诱导组的表达显著低于WT-BMMSCs 成骨诱导组(P＜0.001)，而GK-BMMSCs 成骨诱导组的表达与未诱导组无统计学差异。WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨诱导组成骨基因RUNX2 表达均显著高于未诱导组，而GK-BMMSCs 成骨诱导组的表达显著高于WT-BMMSCs 成骨诱导组(P＜0.001；图9)。

图8 成骨诱导7 d 正常与2 型糖尿病大鼠BMMSCs ALP、OCN 、RUNX2、COL1 的mRNA 表达(n=3)Fig.8 Expression level of the osteoblast differentiation-related genes ALP, OCN, RUNX2, COL1 on day 7 after osteogenic differentiation by real-time PCR (n=3)

图9 成骨诱导7 d 正常与2 型糖尿病大鼠BMMSCs ALP、OCN、RUNX2 蛋白水平的表达A： ALP、OCN、RUNX2 蛋白的表达； B：ALP、OCN 、RUNX2 蛋白水平表达的定量分析(n=3)Fig.9 Western blot analysis of ALP, OCN, RUNX2 on day 7 after osteogenic differentiation A：Western blotting of ALP, OCN, RUNX2；B：Protein levels of ALP, OCN, RUNX2 quantified by densitometry (n=3)

5 WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs成骨分化中miR-145-5p、SEMA3A 及β-catenin 的表达 qRT-PCR 结果显示，成骨诱导7 d 时WT-BMMSCs miR-145-5p表达显著低于未诱导组(P＜0.05)，GK-BMMSCs成骨诱导组的表达相反且显著高于WT-BMMSCs成骨诱 导 组(P＜0.001)。WT-BMMSCs 和GKBMMSCs 成骨诱导组SEMA3A 的表达均显著低于未诱导组(P＜0.001)，GK-BMMSCs 成骨诱导组的表达显著低于WT-BMMSCs 成骨诱导组(P＜0.05)。WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨诱导组成骨通路关键蛋白β-catenin 的表达均显著高于未诱导组(P＜0.01)，GK-BMMSCs 成骨诱导组的表达显著低于WT-BMMSCs 成骨诱导组(P＜0.01；图10)。Western blot 结果显示，WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 诱导组SEMA3A 表达均显著高于未诱导组，GK-BMMSCs 诱导组的表达与WTBMMSCs 诱导组无统计学差异(P＜0.05；图11)。

图10 成骨诱导7 d 正常与2 型糖尿病大鼠BMMSCs miR-145-5p、SEMA3A、β-catenin 的表达(n=3)Fig.10 Expression levels of miR-145-5p, SEMA3A, β-catenin on day 7 after osteogenic differentiation by real-time PCR (n=3)

图11 成骨诱导7 d 正常与2 型糖尿病大鼠BMMSCs SEMA3A 的蛋白表达A：SEMA3A 蛋白的表达；B：SEMA3A 蛋白水平表达的定量分析(n=3)Fig.11 Western blot analysis of SEMA3A on day 7 after osteogenic differentiation A: Western blotting of SEMA3A; B: Protein levels of SEMA3A quantified by densitometry (n=3)

讨 论

糖尿病作为一种常见代谢性疾病，其引起的骨质疏松等疾病严重危害人类健康[14]。BMMSCs是理想的骨再生医学种子细胞，具有自我更新和多向分化潜能，其成骨分化功能降低是骨质疏松症发病的重要机制[13]。以往研究表明，糖尿病高糖微环境会导致BMMSCs 成骨分化能力降低从，而导致骨密度降低和骨再生障碍，其具体机制尚不十分清楚[5-6]。研究显示，miRNAs 在干细胞成骨分化中具有重要的作用。因此，本研究探讨了正常大鼠与2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化能力及在成骨分化中miR-145-5p、SEMA3A、β-catenin表达的差异。

GK 大鼠是非肥胖自发Ⅱ型糖尿病大鼠模型，表现出与人类糖尿病相似的代谢、内分泌、血管疾病和糖尿病并发症。高血糖和胰岛素抵抗是T2DM 的主要症状。本研究中高脂高糖饲料喂养后GK 大鼠的高血糖符合T2DM 的特点。实验成功建立了稳定的2 型糖尿病大鼠模型[15]。我们培养的正常大鼠和2 型糖尿病大鼠BMMSCs 阳性表达间充质干细胞表面标志物，阴性表达造血干细胞表面标志物并能向成骨分化，符合干细胞特性[16]。2 型糖尿病大鼠BMMSCs 的增殖能力、细胞集落形成能力和成骨分化能力降低，这与以往研究结果一致[5,17]，提示2 型糖尿病导致股骨BMMSCs 的功能障碍。有研究证实，干细胞在成骨分化过程中经历增殖期、分化期、矿化期和凋亡期四个阶段，而后形成骨细胞，在增殖期(1 ~7 d)，增殖相关基因、COL1 和成骨分化相关基因RUNX2、OPN 高表达，ALP、OCN 低表达；在分化期(7 ~ 14 d)，增殖相关基因、COL1 和成骨分化相关基因RUNX2、OPN 表达下降，ALP、OCN表达升高[18]。值得注意的是，在本研究中，培养7 d 时，2 型糖尿病大鼠BMMSCs 的增殖能力、细胞集落形成能力和成骨分化相关标志物ALP、OCN 的蛋白表达水平低于正常大鼠BMMSCs，而RUNX2 蛋白表达水平却高于正常大鼠BMMSCs。这些结果提示2 型糖尿病大鼠BMMSCs 从增殖期向分化期转变晚于正常大鼠BMMSCs。

研究表明，miR-145-5p 抑制细胞成骨成软骨分化。Zhu 等[8]报道miR-145-5p 靶向SOX9 抑制正常人脂肪间充质干细胞COL2、聚集蛋白聚糖的表达。Yu 等[19]报道miR-145-5p 抑制TLR4 信号通路降低正常人脂肪间充质干细胞成骨分化能力。Liu 等[10]报道miR-145-5p 靶向SEMA3A 降低Wnt通路基因 Wnt3a、Wnt10a 的表达，抑制2 型糖尿病大鼠脂肪间充质干细胞成骨分化相关基因ALP、RUNX2、COL1 的表达。我们的研究发现，在正常大鼠BMMSCs 成骨分化中，成骨分化相关标志物ALP、OCN、COL1、RUNX2 表达升高，miR-145-5p 表达降低，SEMA3A 和β-catenin 表达升高，这些结果与以上研究一致。提示miR-145-5p 可能通过靶向SEMA3A 调控β-catenin 来抑制正常大鼠BMMSCs 成骨分化。而在2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化中，miR-145-5p、SEMA3A和β-catenin 表达均升高；miR-145-5p 和SEMA3A不是负向调控，可见miR-145-5p 在糖尿病源MSCs 成骨分化中有多种调控途径，其具体的调控网络仍存在争议，我们后续研究将进一步探讨。另有研究者报道在骨关节炎患者的软骨组织中，miR-145-5p 的表达显著高于非骨关节炎患者，miR-145-5p 靶向Smad4 降低 Sox-9、Col-2a1、聚集蛋白聚糖的表达，抑制骨关节炎患者源骨髓间充质干细胞的增殖和成软骨分化[9]。在我们的研究中，经成骨诱导后，2 型糖尿病大鼠BMMSCs miR-145-5p 的表达显著高于正常BMMSCs，SEMA3A和β-catenin 表达显著低于正常BMMSCs。这些结果提示miR-45-5p 在2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化关键途径中也发挥重要的抑制作用。

综上所述，本研究结果提示，2 型糖尿病大鼠BMMSCs 细胞增殖、集落形成及成骨分化能力降低，我们推测正常大鼠BMMSCs 成骨分化中miR-145-5p 起抑制作用，2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化中miR-145-5p 起促进作用，miR-145-5p 是否靶向SEMA3A 通过Wnt/β-catenin 调控成骨仍需要进一步研究。miR-145-5p 或许可作为治疗糖尿病引起的骨代谢疾病的关键靶点。

作者贡献戴雅文：细胞及分子生物学实验，文章撰写；鄂玲玲：课题设计，课题指导；郑颖、马小草：文章修改，文章审阅，文章校正；张戎：文献收集和整理；时权：统计分析；刘洪臣：写作指导，修订，终审论文。

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