蛛网膜下腔出血患者不同神经功能恢复结局之间microRNAs表达差异的meta分析

韩 岳，左积文，陈丽丽，王 静

（1.正定县人民医院外三科，石家庄 050800；2.石家庄市第四医院产二科，石家庄 050011）

蛛网膜下腔出血 (subarachnoid hemorrhage，SAH)是一种急性出血性脑血管疾病，占所有脑卒中患者的 5%～10%[1]。全球SAH 的年发病率为每十万人6～27.63 例[2]。SAH 具有极差的预后，约35%的患者在发病后的一个月内死亡[3]。幸存者中仍有约40%的患者会终身残疾，日常生活需要依赖他人照料[4]。目前，预测SAH 患者的神经功能恢复结局多依赖于临床评分和影像学结果，但准确度较低[5]。因此迫切需要深入研究SAH 患者神经功能恢复结局相关的生物标志物。微小核糖核酸（micro-ribonucleic acid，microRNA）是一类长度约为19～25 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子，已有研究证实microRNA 与多种心血管疾病及神经系统疾病相关[6-8]。在SAH 的发生发展过程中，microRNA 也被证实具有重要的调节作用[9]。然而，SAH 患者不同神经功能恢复结局之间的microRNA表达差异仍然缺乏研究。因此本文将分析SAH 患者不同神经功能恢复结局之间的microRNA 表达差异，为microRNA 作为判定神经功能恢复结局的生物标志物提供循证医学证据。

1 材料与方法

1.1 资料来源

1.1.1 文献来源：检索英文数据库：PubMed，EmBase，Cochrane library；检索中文数据库：中国知网（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、万方数据（wanfang data）知识服务平台、重庆维普中文科技期刊数据库（China Science and Technology Journal Database，CSTJ）、中国生物医学文献服务系统（Sino Med）。基因表达数据库：高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）以及芯片表达谱数据库Array Express。检索时间设定为从数据库建库至2022 年8 月。检索不设置语言限制。

1.1.2 纳入排除标准：纳入标准为：①文献中的研究对象为SAH 患者；②检测了SAH 患者循环血液或脑脊液中microRNA 的水平，并对数据进行了报道；③研究报道了SAH 患者的神经功能结局。排除标准：①动物研究或体外细胞研究；②重复发表的文章或实验数据；③学位论文、会议摘要、信件综述等；④未报道原始数据的研究。

1.2 方法

1.2.1 检索方法：英文检索式为(“subarachnoid hemorrhage”) AND (“microRNA” OR “microRNA” OR “noncoding RNA” OR “non-coding RNA”)。中文检索式为：蛛网膜下腔出血 and（小RNA or microRNA or microRNA or 非编码RNA or 微小核糖核酸）。两名研究员分别从标题和摘要中独立筛选符合纳入排除标准的文献，遇到争议通过相互讨论或与第三位研究人员协商解决的方式达成一致意见。通过文献数据库检索，共得到英文研究392 篇，去除重复后得到281 篇。得到中文研究 534 篇，去重后得到486 篇。并在GEO 和Array Express 数据库中，得到11 个数据集。对去重后的778 项研究进行题目和摘要筛查，排除不相关文献742 篇。之后对36 篇文献进行全文查看，排除30 篇研究，最终纳入6 篇文献。文献筛选流程见图1。纳入文献提取获得的内容包括：第一作者姓名、发表年份、研究地点、患者数量、样本来源、microRNA 检测方法或平台、不良结局判定方式。

图1 文献筛选流程图

1.2.2 文献质量评价：由两名研究员使用Cochrane所推荐的诊断准确性研究质量评估第二版（Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies 2，QUADAS-2）量表对纳入研究进行设计质量评估。评估内容包括了病例的选择、待评价试验、金标准、病例流程和进展情况四个方面。

1.3 统计学分析 采用均数差值（mean difference,MD)及其95%置信区间 (confidence interval，95%CI)对microRNA 表达结果数据进行合并。I2统计量用于评估研究之间的异质性。I2≥50% 时认为具有明显异质性，采用随机效应模型进行分析；否则认为不具有明显异质性，采用固定效应模型进行分析[10]。所得到的P值采用BH（Benjamini &Hochberg）法进行矫正。P＜0.05 为差异具有统计学意义。Begg’s和Egger’s检验用于评估潜在发表偏倚。使用在线数据库mirWalk Version 3.0（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）对有统计学差异的microRNA 靶基因进行筛选。选择在mirWalk 数据库所含的3 个亚数据库（TargetScan，miRTarBase和miRDB）中得以证实的基因作为最终靶基因。对靶基因进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。使用 R 版本 4.2.0 中的“clusterProfile”包进行基因富集分析[11]。

2 结果

2.1 纳入文献基本特征 见表1。最终共有6 项研究[12-17]符合纳入标准。研究发表于2017～2022 年。研究地点为中国和丹麦。两篇研究采用了脑脊液样本[13-14]，其余研究采用了外周血和血清样本。两篇研究采用了microRNA 芯片进行microRNA 检测[13-14]，其余研究采用了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）进行检测。纳入研究均采用了改良Rankin 量表（modified Rankin Scale，mRS）评估神经功能恢复结局。检测时间点分别为3 个月、6 个月和9 个月。

表1 纳入研究的基本特征

在纳入研究质量方面，有一项研究未明确患者的纳入排除标准[12]。有一篇研究仅接受了弹簧圈动脉瘤栓塞术治疗的患者[17]。另外，一篇纳入了高压氧治疗后的SAH 患者[16]。上述不同的患者纳入排除标准会造成研究间的异质性。但总体来说，纳入研究设计质量方面较为理想，见图2。

图2 纳入文献的设计风险偏倚图

2.2 Meta 分析结果 见表2。固定效应模型显示miR-152-3p[I2=0%,MD=-0.31,95%CI（-0.50,-0.13）,矫正后P=0.006]，miR-221-3p[I2=0%,MD=-0.26，95%CI（-0.40，-0.11），矫正后P=0.005]，miR-34a-5p[I2=1.7%，MD= -0.28，95%CI（-0.46,-0.11），矫正后P= 0.009]在神经功能恢复良好患者的脑脊液中表达水平低于神经功能恢复不良患者，差异具有统计学意义。而miR-210-3p[I2=0%，MD=0.23，95%CI（0.10,0.37），矫正后P= 0.006]和miR-193b-3p[I2= 0%，MD=0.16，95%CI（0.12,0.20），矫正后P= 0.002]在神经功能恢复良好患者的脑脊液或循环血中表达水平高于神经功能恢复不良患者，差异具有统计学意义。由于目前纳入研究数量较少，未进行发表偏倚的评估。另外，虽然在固定效应模型中miR-9-3p（矫正后P= 0.009）和miR-27a-3p（矫正后P＜0.001）水平在神经功能恢复良好的患者中高于神经功能恢复不良患者，但上述结果异质性均较高，分别达94.7%和76.4%。而miR-9-3p 和miR-27a-3p 的基于随机效应模型合并结果并未显示出差异具有统计学意义 (矫正后P=0.237,P=0.853)。

表2 microRNA 在不同神经功能结局SAH 患者中表达水平的meta 分析结果

2.3 生物信息分析结果 见图3。对差异表达microRNA 的靶基因进行KEGG 富集分析。在神经功能恢复良好的人群中显著下调的microRNA 靶基因富集结果显示，基因富集于Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B（PI3K-AKT）等信号通路中。而显著上调的microRNA 靶基因富集结果同样显示富集于PI3K-AKT 等信号通路中。

图3 差异表达microRNA 的靶基因KEGG 富集分析

进一步通过KEGG 数据库，对PI3K-AKT 细胞通路中不同靶基因进行标注。发现在神经功能恢复良好的人群中表达降低microRNA 的靶基因包括phosphoinositide 3-kinase（PI3K）等相关基因。而在表达增高的microRNA 靶点包含PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten）等相关基因，见图4。

图4 在PI3K-AKT 信号通路中示意神经功能恢复良好人群中显著下调microRNA 的靶基因（红色）和显著上调microRNA 的靶基因（蓝色）

3 讨论

本研究采用meta 分析的方式，阐明了SAH 患者不同神经功能恢复结局之间microRNA 的表达差异。结果认为miR-152-3p，miR-221-3p 和miR-34a-5p 在神经功能恢复良好患者中表达水平低于恢复不良患者，差异具有统计学意义。miR-210-3p 和miR-193b-3p 在神经功能恢复良好患者中表达水平高于恢复不良患者，差异具有统计学意义。对上述差异表达microRNA 的靶基因进行富集分析后认为，PI3K-AKT 信号通路可能在神经功能恢复转归中发挥了重要的作用。

本研究结果提示miR-152-3p 在神经功能恢复良好的人群中表达水平较低，结果具有统计学差异。有研究结果认为miR-152 具有预测2 型糖尿病微血管并发症风险的作用，提示miR-152 表达水平可能与微血管形成相关[18]。对于动脉瘤患者，miR-152-3p 水平在颅内动脉瘤破裂患者的脑脊液中相较于未破裂患者显著升高，并能够独立预测颅内动脉瘤破裂风险。其作用机制可能与人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs）的增殖和迁移相关[19]。miR-152-3p 也可能通过影响HVSMCs 的增殖和表型转换来影响SAH 后血管重塑和血管痉挛[20]。在缺氧条件下miR-152-3p 能够靶向作用于DDX6（DEAD-box helicase 6）基因加重血管内皮细胞的功能障碍[21]。上述研究提示高miR-152-3p 水平可能通过抑制HVSMC 细胞增殖并造成内皮细胞功能障碍，从影响了血管重塑和造成血管痉挛，进一步引起神经功能恢复不良。

miR-221-3p 也被认为与2 型糖尿病微血管并发症风险相关[22]。在机制研究中，miR-221-3p 能够抑制HVSMCs 的增殖[23]。在一篇纳入的研究中，miR-221 水平的升高与SAH 后发生迟发性脑缺血的风险相关[13]。另外，一篇临床研究也发现，在急性缺血性脑卒中人群中，发生迟发性抑郁症患者血清miR-221-3p水平显著高于未发生抑郁症人群[24]。而卒中后抑郁症的发生与较差的神经功能结局相关[25]。因此，高miR-221-3p 水平也可能通过影响HVSMC 增殖和血供重建，造成了神经功能恢复不良。

对于miR-34a-5p，在动脉瘤破裂发生SAH 的人群血清中，水平显著高于健康对照人群[26]。基础研究认为在布比卡因诱导的神经毒性模型中miR-34a-5p 水平上调[27]。miR-34a-5p 水平上调也与小鼠认知障碍相关[28-29]。另外，研究发现随着年龄的增加，小鼠大脑内miR-34a-5p 表达水平逐渐增高[30]。因此，miR-34a-5p 更可能通过抑制神经细胞再生和突触重塑[29]来影响SAH 患者的神经功能恢复。

在神经功能恢复良好的患者中，miR-210-3p 和miR-193b-3p 表达显著上调。在一项有关脑梗死的临床观察研究中，认为血清miR-210 表达的降低是脑梗死患者预后不良的独立危险因素[31]。从机制上，体外研究证实了通过间充质干细胞衍生的细胞外囊泡，能够通过促进神经干细胞miR-210-3p 的表达，来预防缺氧损伤以及细胞凋亡[32]。在SAH 患者高压氧治疗作用机制研究中，治疗后miR-193b-3p 表达水平增高与神经功能恢复良好相关[16]。循环miR-193b-3p 的增加也被认为能够减轻SAH 动物模型的神经行为障碍、脑水肿、血脑屏障损伤和神经变性，并降低SAH 后脑组织内炎性因子的表达水平[33]。同时在动物模型中，miR-193b-3p 干预也能够减轻脑缺血再灌注损伤，并起到神经保护作用[34-35]。因此，miR-210-3p 和miR-193b-3p 可能通过抑制神经细胞凋亡和降低炎性反应水平等机制起到了神经保护作用，有益于SAH 后神经功能恢复。

靶向基因富集分析中，PI3K-AKT 信号通路与SAH 患者神经功能恢复结局相关。具体为PI3K 活性增加，PETN 活性降低与神经功能恢复良好相关。PI3K-AKT 通路在SAH 中的作用机制，包括减轻神经细胞自噬，维持血脑屏障完整性，降低脑含水量，减轻神经炎症和缓解白质损伤等多个方面。在SAH动物模型中，PI3K-AKT 信号通路活性升高有助于减轻脑水肿，维持血脑屏障完整性，减少脑内浸润中性粒细胞数量，从而促进了SAH 发生后的神经功能恢复[36]。同时，PI3K-AKT 信号通路活性升高能够通过缓解白质损伤以促进神经功能恢复[37]。采用碱性成纤维细胞生长因子对SAH 动物模型进行干预后，使PI3K-AKT 信号通路活性升高，抑制了神经细胞自噬，降低了脑含水量，从而减轻脑损伤并促进神经功能恢复[38]。近期发表研究认为脂肪基质细胞所释放的外泌体以及烟碱型乙酰胆碱 α7 受体（α7-AChR）激动剂加兰他敏，均能够直接上调PI3K/AKT 信号通路，从而增加神经细胞的存活，进而缓解SAH 造成的神经功能障碍[39-40]。

本研究仍然具有以下缺陷：①本研究假定了所有纳入的SAH 患者均得到了良好治疗，并且患者特征及治疗因素在恢复良好和恢复不良的人群中分布平衡。但实际中仍需考虑患者特点或治疗因素对结果产生的影响。②本研究仅纳入了6 项研究，其中的两项研究来自于同一团队。仍然需要更多的研究来对本研究结果进行验证。③本研究所分析的样本包括外周血和脑脊液。虽然microRNA 具备穿越血脑屏障的能力，不同的样本来源仍然可能会对结果造成影响。④所有研究均排除了在随访期间死亡的患者，该部分患者的缺失可能会对结果造成影响。

综上所述，本研究通过综合分析SAH 患者不同神经功能恢复结局之间microRNA 的表达差异，认为在神经功能恢复良好患者中，miR-152-3p，miR-221-3p 和miR-34a-5p 水平下调，而miR-210-3p 和miR-193b-3p 水平上调，差异具有统计学意义。通过靶向基因KEGG 富集分析，认为PI3K-AKT 信号通路在SAH 患者神经功能恢复中起到了关键的作用。