原发性舍格伦综合征患者血清miR-193b表达水平及其临床价值研究

石 娴，傅曼妮，解翠林（鄂东医疗集团黄石市中心医院/湖北理工学院附属医院皮肤科，湖北黄石 435000）

原发性舍格伦综合征（primary Sjogren’s syndrome，pSS）是一种自身免疫性结缔组织疾病，好发于30～40 岁或绝经期女性[1]，发病隐匿，主要侵犯外分泌腺而引起眼干、口干等，后期可导致全身多器官损伤[2]。目前，该病病因及发病机制尚未完全清楚，一般认为免疫遗传、病毒感染、淋巴细胞功能异常等多种因素共同导致了pSS 的发生[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）作为一种含18～23 个核苷酸的高度保守且广泛存在于机体内的小RNA 分子，可通过负性调控靶基因而参与多种生理病理过程[4]，近年来研究发现[5]，其参与了免疫炎症、肿瘤、退行性等疾病的发生进展过程。miR-193b 作为一种miRNA，可能通过调控人类Th17 细胞分化而参与免疫炎症性疾病的发生[6]。但miR-193b 是否参与了pSS 发病，鲜有报道。本研究拟对pSS 患者血清中miR-193b 表达情况进行检测，探讨其与pSS 发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2015 年9 月～2020 年9 月在黄石市中心医院治疗的98 例pSS 患者作为研究对象，其中，男性13 例，女性85 例，平均年龄51.51±9.57 岁，平均病程99.92±50.17 月，纳入标准：①首次确诊；②均符合原发性舍格伦综合征诊断标准；③临床资料完整。排除标准：①继发原因导致的舍格伦综合征；②心肝肾等重要脏器严重功能障碍者、急慢性感染和恶性肿瘤患者，以及呼吸、自身免疫和血液系统疾病者；③长期使用激素、抗风湿及免疫抑制剂治疗者。根据患者病情按照欧洲抗风湿联盟舍格伦综合征疾病活动指数（ESSDAI）[7]将患者分为轻度组（n=31）、中度组（n=43）和重度组（n=24）。同期，从我院体检中心选取健康体检者45 例作为对照组，其中，男性7例，女性38 例，平均年龄52.03±10.06 岁，均排除免疫炎症性疾病。两组研究对象在性别、年龄上差异无统计学意义（χ2=0.134,t=0.305,P＞0.05）。本研究通过医院伦理委员会批准（批准文号：EDYLJTHSSZXYY201409036630），所有患者均知情同意。

1.2 仪器与试剂 500 型实时荧光定量PCR 仪为ABI 公司产品，Trizol 总RNA 提取试剂盒为Invitrogen 公司（美国）；逆转录试剂和PCR 扩增试剂盒为TaKaRa 公司产品（中国大连），引物设计并合成为生工生物公司（中国上海）。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集：研究对象性别、年龄、疾病史、实验室检测、眼科干眼症检查、唾液流率等指标，以及ESSDAI 和欧洲抗风湿联盟舍格伦综合征患者报告指数（ESSPRI）评分。泪流量的测定方法是：将特定的试纸条放入双眼结膜囊内，观察试纸湿润的长度，5min 湿润长度≤5mm 提示泪腺分泌量减少；唾液流率的测定方法是：用特定的导管，将负压导管置于单侧腮腺导管开口处，进行2min 唾液分泌量的收集，用于反映腮腺分泌功能。ESSDAI包括全身情况、淋巴结病、皮肤表现、关节异常、腺体受累、肌肉受累、呼吸受累、泌尿受累、外周神经受累、中枢神经受累、血液受累及生物学指标，各项根据由轻到重给予0～3 分；ESSPRI 包括躯体/精神疲倦、干燥症状和疼痛，每项0～10 分，评分越高则越严重。

1.3.2 qPCR 检测血清miR-193b：集晨起空腹静脉血5.0 ml，3 500r/min 离心15min，血清-80℃保存。取血清，加入细胞裂解液，用Trizol 总RNA 提取试剂提取总RNA，检测其纯度和浓度。用逆转录试剂将RNA 反转录为cDNA，逆转录反应体系：总RNA 5.0μl，5×RT Primer 3.0μl，Reverse Transcriptase 1.0μl，dNTP Mix 0.15μl，RNase Inhibitor 0.20μl，10×Reaction Buffer 1.5μl，DEPC 处理水9.15μl。逆转录条件：42℃ 60min，95℃ 10min。PCR 反应体系20μl：dNTPs 0.3mmol/L，2×PCR buffer 2μl，Taq DNA 聚合酶1U，模板DNA 40ng，上下游引物各0.8μmol/L，加双蒸水至20μl。引物：miR-193b：上游：5’-AACTGGCCCTCAAAGTCC-3’，下游：5’-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTAGCG-3’；U6：上游：5’-GGATGACACGCAAATTCGTGAAG C-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR 条件：95℃ 2min，然后95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，38 次循环。以U6 为内参照，使用2-△△Ct法计算miR-193b 的相对表达量。

1.4 统计学分析 利用SPSS 21.0 统计软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间资料比较采用成组设计资料的t检验、多组资料比较采用两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的LSD-t检验，指标间相关性分析采用Pearson 相关，采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristics curves，ROC）分析血清中miR-193b 表达量对pSS 患者诊断价值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pSS 患者血清中miR-193b 相对表达量 miR-193b 相对表达量在对照组、pSS 轻度组、pSS 中度组和pSS 重度组分别为1.79±0.31，1.91±0.21，2.46±0.25 和3.11±0.22，差异有统计学意义（F=165.948，P＜0.001），且pSS 重度组＞pSS 中度组＞ pSS 轻度组＞对照组（t=10.720,9.924,2.029,均P＜0.05）。

2.2 pSS 患者的实验室检查及临床指标 见表1。pSS 患者轻度组、中度组和重度组在年龄、病程时间、C3，C4，IgA 和IgM 差异均无统计学意义（均P＞0.05）；重度组和中度组患者B 细胞比例、ESR，IgG，ESSDAI 评分、ESSPRI 评分和miR-193b表达量均高于轻度组（均P＜0.05），而白细胞数、唾液流率和泪流量均低于轻度组（均P＜0.05）；重度组患者ESR，IgG，ESSPRI 评分，miR-193b 表达量高于中度组，而泪流量低于中度组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；重度组和中度组在B细胞比例、白细胞数、唾液流率和ESSDAI 评分差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 不同严重程度pSS 患者临床指标比较（±s）

表1 不同严重程度pSS 患者临床指标比较（±s）

注：*与轻度组比较，t=4.951,5.025; 2.821,2.474; 2.249,5.468; 6.267; 2.800,4.668; 2.754,3.076; 3.208,4.366; 2.075,4.201,均P＜0.05；#与中度组比较，t=3.651,5.400,2.200,2.129,均P＜0.05。红细胞沉降率：erythrocyte sedimentation rate，ESR。

项 目轻度组（n=31）中度组（n=43）重度组（n=24）FP年龄（岁）53.10±9.6850.77±8.8650.79±10.750.6180.541病程时间（月）97.84±46.9899.84±54.54102.75±47.860.0640.938 B 细胞比例（%）9.75±3.5214.19±4.01*15.58±5.08*15.853＜0.001白细胞数（×109/L）4.45±1.583.46±1.42*3.47±1.30*4.9560.009 ESR（mm/h）14.77±7.6919.19±8.78*27.75±9.92*#15.121＜0.001 IgG（g/L）16.29±5.4018.40±4.8525.02±4.74*#21.965＜0.001 C3（g/L）0.80±0.140.77±0.200.80±0.170.3140.731 C4（g/L）0.22±0.080.21±0.080.21±0.080.1810.835 IgA（g/L）2.88±0.172.89±0.132.90±0.130.1260.881 IgM（g/L）0.99±0.121.03±0.131.04±0.111.3340.268泪流量（mm/5 min）6.62±2.674.91±2.52*3.62±1.89*#10.608＜0.001唾液流率（g/2 min）3.67±1.702.64±1.50*2.27±1.64*6.0070.003 ESSDAI 评分（分）1.90±0.982.88±1.48*3.17±1.17*8.1120.001 ESSPRI 评分（分）2.39±1.433.14±1.61*3.96±1.30*#7.5970.001

2.3 pSS 患者血清miR-193b 表达量与临床指标相关性 将pSS 患者随病情变化有意义的指标与miR-193b 进行Pearson 相关分析，结果发现pSS 患者血清中miR-193b 表达量与B 细胞比例、ESR，IgG，ESSDAI 评分和ESSPRI 评分呈正相关（r=0.432，0.554，0.448，0.356，0.361，均P＜0.05），而与白细胞数、唾液流率和泪流率呈负相关（r=-0.215，-0.323,-0.369，均P＜0.05），与年龄、病程时间，C3，C4，IgA 和IgM 无关（均P＞0.05）。

2.4 血清中miR-193b 表达量对pSS 患者诊断价值ROC 曲线分析 见图1。血清miR-193b 诊断pSS的曲线下面积为0.864（95%CI：0.805～0.923），以血清miR-193b 表达量2.06 为截断值诊断pSS，其诊断灵敏度和特异度分别为78.57%，82.22%。

图1 血清miR-193b 表达量诊断pSS 的ROC 曲线

3 讨论

pSS 起病隐匿，发病机制复杂，以外分泌腺功能损害及淋巴细胞浸润为主要特征，发病率呈升高趋势[8]，且临床症状多样，病程长，给患者生活质量带来严重影响。miR-193b 作为一种miRNA，多项研究发现，miR-193b 可抑制甲型流感病毒感染[10]，参与了过敏性疾病的发生[11]、脓毒症神经炎症发病[12]和自身炎症性皮肤病银屑病的异常炎症反应[13]，这些研究表明miR-193b 可能与免疫炎症反应性疾病关系密切。同时，有研究指出[14]，pSS 患者唾液中存在miRNA 表达谱异常。本研究结果显示，pSS 患者血清中miR-193b 表达量高于对照组，说明miR-193b 可能参与了pSS 发病。

2009 年欧洲风湿病防治联合会建立了评估pSS疾病活动和病情的ESSDAI，但该工具在评估患者症状及主诉方面欠佳，于是再次开发了一种由患者自行填写评估症状的问卷ESSPRI，用于反映患者对疾病严重程度的主观感受[15]。本研究根据患者ESSDAI 评分对pSS 患者进行分组，结果显示，重度组患者血清中miR-193b 表达量高于中度组，且中度组高于轻度组，说明miR-193b 表达与pSS 患者病情严重程度有关。Pearson 相关分析结果亦显示，pSS 患者血清中miR-193b 表达量与ESSDAI评分和ESSPRI 评分呈正相关，进一步说明miR-193b 表达量与pSS 患者病情严重程度有关，可能参与了pSS 患者病情进展过程。

研究表明[16]，B 细胞在pSS 发病中发挥重要作用，在pSS 患者外周血和涎腺组织中出现异常表达。同时，多克隆B 细胞活化可引起自身抗体大量产生及球蛋白水平升高，介导免疫炎症发生[17]。本研究Pearson 相关分析结果显示，pSS 患者血清中miR-193b 表达量与B 细胞比例和IgG 呈正相关，进一步说明miR-193b 可能参与了B 细胞介导的pSS 发病过程。有研究指出[18]，炎症细胞在涎腺和泪腺等外分泌腺组织中聚集可导致pSS 病情进展，引起腺泡不可逆的破坏及功能减低。本研究结果显示，pSS 患者血清中miR-193b 表达量与ESR 呈正相关，而与白细胞数、唾液流率和泪流率呈负相关，进一步说明miR-193b 可能参与了pSS 病理过程，与炎症反应及外分泌腺损伤密切相关。本研究结果显示，血清中miR-193b 表达量在预测pSS 发生时曲线下面积为0.864，当血清中miR-193b 表达量为2.06 时，灵敏度和特异度分别为78.57%，82.22%，说明血清中miR-193b 表达量在预测pSS 发病时具有较好的灵敏度和特异度，有望成为临床上诊断pSS 的潜在生物学指标。

综上所述，pSS 患者血清中miR-193b 表达量升高，且与疾病活动度和腺体功能有关，对pSS 患者的诊断具有指导价值。但miR-193b 在pSS 发病过程中的具体作用机制尚未清楚，仍需开展更深入的研究予以明确。