未破裂颅内动脉瘤患者血清miR-135b和miR-145表达水平及临床价值研究

韩 韶，侯艳苹，马岩朋（.邯郸市第一医院神外三科，河北邯郸 056000；.邢台市人民医院神经内四科，河北邢台 05403）

未破裂颅内动脉瘤（unruptured intracranial aneurysms，UIA）是指颅内动脉血管壁出现异常膨出而形成瘤体，在老年人中较为常见[1]，一旦破裂可引发蛛网膜下腔出血，严重危及患者生命，致死率及致残率较高，预后较差[2-3]，且UIA 随时可能破裂而危及患者生命，因此寻找特异性生物标志物对高风险动脉瘤患者进行早期筛查具有重要意义。微小核糖核酸（microRNA，miR）广泛参与人体的各种生理及病理过程，对血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的生物学功能具有调控作用[4]。而血管内皮细胞及血管平滑肌细胞功能的异常改变会导致血管破坏及重构，这也是导致动脉瘤形成的重要机制[5-6]。miR-135b 和miR-145 是常见的miRNA，miR-135b通常在癌症中发挥促癌基因的作用[7]，并参与调控血管平滑肌细胞的增殖和凋亡，而miR-145 则通常发挥抑癌基因的作用[8]，并有抑制血管生成及纤维增生的作用[9]，因此推测miR-135b 及miR-145 可能通过调节血管功能影响颅内动脉瘤的形成及破裂。然而有关miR-135b 及miR-145 对颅内动脉瘤的调控作用却鲜少报道。本研究将检测UIA 患者血清miR-135b 和miR-145 的表达，比较miR-135b，miR-145 与UIA 患者临床特征的关系，探讨其对UIA 的预测价值，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取邯郸市第一医院神外三科2018 年5 月～2020 年3 月期间收治的102 例UIA患者作为研究组，收集整理患者的临床资料，其中男性59例，女性43例，年龄32～78（57.75±10.56）岁，中位年龄58 岁。纳入标准：①经颅内血管造影或核磁共振血管成像检查，确诊为UIA；②患者为初次发病，入院前未接受任何治疗；③患者临床资料完整；④患者本人或家属知情同意本研究，签署同意书。排除标准：①并发其他系统恶性肿瘤；②伴有肝、肾或其他脏器功能严重损伤者；③有严重头部外伤史；④有脑卒中病史；⑤临床资料不全。另选同期在我院参加体检的95例健康者作为对照组，其中男性53例，女性42例，年龄32～75（58.64±9.83）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义（χ2=0.085，t=0.606，P=0.771，0.545），本研究所有程序均符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 总RNA 提取试剂（total RNA extraction reagent，Trizol）（上海尚宝生物科技有限公司），逆转录试剂盒（上海康朗生物科技有限公司），引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，实时荧光聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 血清样本收集：采集患者入院当天或第二天清晨、体检者体检当日清晨的空腹静脉血4 ml，3 000 r/min×10 min，分离血清，置于-80℃条件下保存。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中miR-135b，miR-145表达水平：取血清，按照试剂盒操作步骤分离提取总RNA，逆转录得到cRNA。PCR 反应体系为25μl，体系扩增条件：95℃ 10 min；95℃ 15s，60℃ 1min，共 45 次循环。miR-135b 引物序列：上游：5’-CCTGG CTTTTCATTCCTATGTGA-3’；下游：5’-GCTTCGG CAGCACATATACTAAA-3’；miR-145 引物序列：上游：5’-TGCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA-3’；下游：3’-TGCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA-5’；以U6 为内参。使用2-ΔΔCt方法（Ct为循环阈值）计算miR-135b 和miR-145 的相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件对本研究所收集的数据进行处理，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验进行组间计数资料比较；计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行两组间计量资料比较；采用单因素方差分析进行多组间差异比较，组间进一步两两比较采用SNK-q检验；利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-135b 和miR-145 水平对UIA 形成的诊断价值，计算曲线下面积（area under curve，AUC）；Logistic 分析UIA 形成的影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组与对照组一般资料比较 见表1。研究组患者的年龄、性别、糖尿病比例与对照组相比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；但研究组中高血压、高血脂、吸烟史、饮酒史患者所占比例高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且研究组患者血清miR-135b 水平低于对照组，血清miR-145 水平高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 研究组与对照组一般资料比较[n（%），±s]

表1 研究组与对照组一般资料比较[n（%），±s]

项目研究组（n=102）对照组（n=95）t/χ2P年龄（岁）57.75±10.5658.64±9.830.611 0.542性别（男/女）59/4353/420.085 0.771高血压64（62.75）44（46.32）5.361 0.021糖尿病59（57.84）45（47.37）2.166 0.141高血脂63（61.76）42（44.21）4.986 0.026吸烟史68（66.67）45（47.37）6.139 0.013饮酒史72（70.59）51（53.68）5.993 0.014 miR-135b0.79±0.201.03±0.277.122＜0.001 miR-1451.28±0.240.99±0.228.821＜0.001

2.2 血清miR-135b，miR-145 与UIA 患者临床特征的关系 见表2。UIA 患者血清miR-135b，miR-145 表达水平与年龄、性别、动脉瘤位置和动脉瘤形态无关，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与动脉瘤个数为1 及动脉瘤直径＜7mm 的患者相比，动脉瘤个数≥2 及动脉瘤直径≥7mm 的患者血清中miR-135b 表达水平降低，miR-145 水平升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 血清miR-135b，miR-145 与UIA 患者临床特征的关系（n，±s）

表2 血清miR-135b，miR-145 与UIA 患者临床特征的关系（n，±s）

类 别nmiR-135btPmiR-145tP年龄（岁）＜58460.82±0.22 1.2630.210 1.24±0.21 1.4730.144≥58560.77±0.181.31±0.26性别 男590.76±0.22 1.30±0.27 1.2210.225女430.81±0.181.25±0.20动脉瘤位置 前循环680.80±0.23 1.26±0.23 0.6980.487后循环340.77±0.141.32±0.26动脉瘤个数 1710.84±0.21 1.24±0.21 3.689＜0.001≥2310.68±0.181.37±0.31 1.0260.307 1.1890.237 2.4720.015动脉瘤形态 囊形580.82±0.22 1.26±0.21梭形310.77±0.171.31±0.27 2.0950.129 0.4820.691混合型130.70±0.181.30±0.30动脉瘤直径＜7mm570.85±0.22 3.5180.001 1.21±0.19 3.2810.001≥7mm450.71±0.171.37±0.30

2.3 血清miR-135b，miR-145 对UIA 形成的诊断价值 见表3 和图1。以是否患UIA 为状态变量，以血清miR-135b，miR-145 水平为检验变量绘制ROC 曲线。结果显示，血清miR-135b，miR-145 以及二者联合诊断UIA 的AUC 分别为0.788，0.836 和0.907，二者联合的诊断效能优于血清miR-135b，miR-145 各自单独诊断（Z= 4.236，3.226；P=0.000，0.001）。

图1 血清miR-135b，miR-145 水平预测UIA 形成的ROC 曲线

表3 血清miR-135b，miR-145 水平对UIA 形成的诊断价值

2.4 Logistic 回归分析UIA 形成的影响因素 见表4。以是否患UIA（0=否，1=是）为因变量，以高血压（1=有，0=无）、高血脂（1=有，0=无）、吸烟史（1=有，0=无）、饮酒史（1=有，0= 无）以及血清miR-135b（0=miR-135b＜0.94，1=miR-135b ≥0.94）和miR-145（0=miR-145＜1.22，1=miR-145 ≥1.22）水平为自变量进行Logistic 回归分析，结果显示，高血压、吸烟史、饮酒史、血清miR-135b 水平、血清miR-145 水平均是UIA 形成的影响因素（均P＜0.05）。

表4 Logistic 回归分析UIA 形成的影响因素

3 讨论

UIA 是当颅内动脉在血流动力学负荷等因素的影响下出现血管壁异常膨出的脑血管疾病，在临床较为常见。据报道，有一部分UIA 患者会发生隐匿性动脉瘤破裂，病灶难以察觉，而一旦破裂将严重危及患者生命，即使治疗及时，致残的风险也很大[10]。UIA 患者通常没有明显症状，破裂前往往也无任何征兆，因此对UIA 的早期诊断、早期治疗十分重要。临床上UIA 的诊断一般靠影像学检查[11]，但其操作较为复杂，而血清学指标的检查取材方便，检测速度快，逐渐成为学者们研究的热点。miRNA是非编码小分子RNA，广泛参与包括炎症反应、细胞增殖、干细胞分化等多种生命进程的调节[12]，可在血清中稳定表达，是较为合适的血清学生物标志物。动脉瘤的形成与血管内皮细胞功能障碍、血管平滑肌的凋亡、血管炎症密切相关[13-14]，而这些过程离不开miRNA 的调控，因此miRNA 可能与颅内动脉瘤的形成息息相关。

miR-135b 是近年来新发现的miRNA，在多种疾病尤其是癌症中异常表达，通常被认为是促癌基因，能够促进肿瘤细胞增殖，例如有研究证实卵巢癌组织中miR-135b 表达水平上调，且与患者的临床病理特征有关[15]。不仅如此，有研究表明miR-135b 与血管平滑肌细胞的增殖和血管内皮细胞的功能有关。刘雪琼等[16]研究发现在脂多糖诱导的异常增殖的血管平滑肌细胞中miR-135b-5p 表达升高，miR-135b-5p 可通过阻止细胞周期促进血管平滑肌细胞的增殖。NI 等[17]研究显示通过海绵化miR-135b-5p 可以促进川崎病患者的内皮-间质转化，进而促进动脉瘤的形成。正常情况下，血管平滑肌的增殖和凋亡维持在一个相对稳定的平衡状态，当血管平滑肌过度凋亡，血管壁变薄，承受张力降低，则极易出现异常隆起，形成动脉瘤。苗树船[18]研究发现miR-211 在动脉瘤组织中表达下调，进一步研究证实其可通过抑制血管平滑肌细胞凋亡促进颅内动脉瘤的生成，王如科等[19]研究也发现miR-124可抑制血管平滑肌细胞的增殖，进而促进颅内动脉瘤的生成。以上种种研究表明血管平滑肌的过度凋亡是颅内动脉瘤形成的重要机制，本研究结果显示UIA 患者血清miR-135b 呈低表达，且患者颅内动脉瘤个数越多、直径越大，血清miR-135b 表达水平越低，提示miR-135b 低表达可能通过抑制血管平滑肌细胞的增殖、促进内皮-间质转化，进而促进颅内动脉瘤的形成。

miR-145 是最先在小鼠心肌细胞中发现的微小RNA，后来被证实广泛存在于人体各个组织和器官中，通常被认为发挥抑癌基因的作用，能抑制癌细胞的增殖，在肿瘤组织中呈低表达[20]。但近年来越来越多的研究表明miR-145 与血管平滑肌细胞表型转化及增殖和凋亡过程息息相关。曾丁邻等[21]在研究中证实转染miR-145 的血管平滑肌细胞凋亡率显著提升，miR-145 可以通过促进转凝蛋白的表达抑制血管平滑肌细胞增殖；ZHANG 等[22]研究则证实miR-145 可通过阻止PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活来抑制血管平滑肌细胞的表型转化以及增殖和迁移，这些研究表明miR-145 可通过多种机制调节血管平滑肌细胞的表型转化，抑制血管平滑肌细胞由分化状态转化为未分化状态，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖，促进其凋亡，而血管平滑肌细胞的凋亡是血管瘤生成的重要原因。另外，局部炎性反应也在动脉瘤的发生过程中起着重要的作用，巨噬细胞、T 淋巴细胞、甲基噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多种炎症细胞和因子共同作用可导致动脉血管壁的完整性遭到破坏，逐步退化，炎症的加剧可促进动脉瘤的发展，最终可能引起破裂。有研究提出miR-145 有促炎作用，在炎性疾病中呈现较高表达[23]，本研究结果同样提示miR-145 在UIA 患者血清中水平上调，提示miR-145 可能通过促进血管平滑肌细胞凋亡以及促进炎症反应参与UIA 的形成与发展。ROC 曲线分析结果显示miR-135b 和miR-145 二者联合对UIA的诊断效能较高，或许能为UIA 的早期诊断和治疗提供新的思路，但本研究样本量较小，还需扩大范围做进一步研究证实。另外本研究对miR-135b 和miR-145 参与UIA 发生和发展的调控机制研究不够深入，还有待进行细胞学实验进一步探究，从分子生物学的角度解释其机制。

综上所述，UIA 患者血清miR-135b 水平下调，miR-145 水平上调，二者与UIA 的形成和发展存在相关性，且二者联合对UIA 的诊断效能较高，有望成为UIA 诊断和治疗的潜在生物靶点，但其具体作用机制还需进一步研究。