免疫性血小板减少性紫癜患者血清sPD1和sPD-L1表达及临床意义

田秋霞，许元英，毛怀凤，王 婷，洪 亮

（四川省阿坝藏族羌族自治州人民医院 a.检验科；b.血液科，四川阿坝州 624000）

原发免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenic purpura,ITP)是一种获得性自身免疫性出血性疾病[1]。目前ITP 的治疗以短期大剂量激素治疗为主，但长期激素用药可引起肥胖、高血压及电解质紊乱等[2-3]。ITP 的发生与自身血小板抗原免疫耐受缺失有关，存在T 细胞过度激活的现象[4]。程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)和程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)是T 细胞活化的重要调节通路。可溶性PD-1 (soluble PD-1，sPD-1)和可溶性PD-L1 (soluble PD-L1，sPDL1)是PD-1，PD-L1 的可溶性形式，能够抑制肿瘤杀伤T 淋巴细胞的细胞毒效应[5]。近年来发现，sPD-1 和sPD-L1 能够阻断PD-1/PD-L1 通路，导致1 型辅助性T 细胞（T helper 1,Th1）和2 型辅助性T 细胞（T helper 2,Th2）平衡失调，促进ITP 等自身免疫性疾病的进展[6]。目前ITP 患者血清中sPD-1，sPD-L1 的表达及临床意义尚不清楚。本研究通过检测ITP 患者血清中sPD-1 和sPD-L1 的表达，探讨两者与疾病严重程度及与临床治疗反应的关系，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019 年2 月～2021 年2 月四川省阿坝藏族羌族自治州人民医院收治的ITP 患者114 例作为研究对象（ITP 组）。纳入标准：①ITP的诊断符合2016 年版《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识》[7]；②年龄18 岁以上；③未接受免疫及细胞毒性药物治疗；④所有患者家属知情并签署同意书。排除标准：①并发严重肝肾功能障碍；②并发精神神经系统疾病；③并发恶性肿瘤；④并发结缔组织病、淋巴系统增生性疾病及脾功能亢进等继发性血小板减少；⑤长期使用免疫调节剂。ITP 组中，男性44 例，女性70 例；年龄23～57（39.47±9.24）岁；出血严重程度：隐性和轻度49 例，中重度65 例。另取同期本院42 例化疗后骨髓抑制血小板减少患者作为病例对照组，其中男性15 例,女性27 例；年龄22～56（38.59±8.78）岁。选取同期健康体检的健康者50例作为健康对照组，其中男性20 例，女性30 例；年龄24～59（40.04±7.79）岁。三组性别、年龄比较，差异无统计学意义(χ2=0.310,F=0.184,均P＞0.05)。本研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 仪器与试剂 Multiskan SkyHigh 全波长酶标仪（美国赛默飞公司），人sPD-1 酶联免疫吸附试剂盒（上海科维诺生物科技公司，货号KWN-164604），人sPD-L1 酶联免疫吸附试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，货号HY1304）。

1.3 方法

1.3.1 治疗及疗效评估：参考中华医学会血液学分会止血与血栓学组2016 年制定的《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识》中的标准进行治疗及疗效判定[7]：完全反应:治疗血小板数目（platelet count，PLT）升至≥100×109/L 且无出血。有效：治疗后PLT 升至≥30×109/L 并且至少比基础PLT 增加两倍且无出血。无效：治疗后PLT＜30×109/L 或PLT 增加不到基础值的两倍或者有出血。复发：治疗有效患者，PLT 再次降至30×109/L 以下或者再次出现出血症状。完全反应+有效定义为治疗有反应组（n=80），无效+复发定义为治疗无反应组（n=34）。

1.3.2 酶联免疫吸附实验检测血清sPD-1，sPD-L1水平：取ITP 组入院即刻，病例对照组及健康对照组清晨空腹静脉血5ml，3 000r/min 离心10 min，吸取上层血清。采用酶联免疫吸附实验（双抗体夹心法）检测血清sPD-1，sPD-L1 水平，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。根据标准品浓度的A450nm值，计算每孔样品的浓度值。

1.3.3 观察指标：收集所有研究对象性别、年龄、病程、出血严重程度等一般临床资料。收集实验室检查指标包括PLT，平均血小板体积（mean platelet volume，MPV）及骨髓穿刺涂片巨核细胞数。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。符合正态性分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，三组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。不符合正态性分布的计量资料以中位数（四分位间距）[M(IQR)]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以率(%)表示，组间比较用卡方检验。相关性分析采用Pearson 相关分析。多因素Logistic 回归模型分析影响ITP 患者治疗疗效的因素。绘制受试者工作（receiver operating curve，ROC）曲线分析各独立影响因素及拟合多变量的预测模型对ITP 治疗疗效的预测价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者sPD 1，sPD L1，PLT 及MPV 水平比较 见表1。ITP 组血清sPD 1，sPD L1，MPV 高于病例对照组和健康对照组(t=12.617，20. 661；13.243，23. 388；18.770，11.468，均P＜0.05)，PLT低于病例对照组和健康对照组(t=51.824，124.037，均P＜0.05)，差异具有统计学意义。

表1 各组患者sPD-1，sPD-L1 及PLT，MPV 水平比较

2.2 ITP 组患者血清sPD-1，sPD-L1 水平与PLT，MPV 的相关性 血清sPD-1，sPD-L1 与PLT 呈明显负相关(r=-0.745，-0.810，均P=0.000)，与MPV呈明显正相关(r=0.740，0.796，均P=0.000)。

2.3 不同治疗疗效患者血清sPD-1，sPD-L1 水平及各临床指标比较 见表2。相比于治疗有反应组，治疗无反应组血清sPD-1，sPD-L1 水平较高，而PLT，MPV 水平较低，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 影响ITP 治疗疗效因素的多因素Logistic 回归分析 见表3。以是否ITP 患者治疗疗效（1=治疗无反应，0=治疗有反应）为因变量，以PLT，MPV，sPD-1，sPD-L1 为自变量，多因素Logistic回归分析结果，MPV，血清sPD-1，sPD-L1 是影响ITP 治疗疗效的独立因素。

2.5 ROC 曲线评估MPV，sPD-1，sPD-L1 及联合模型对ITP 治疗疗效的预测价值 见表4，图1。MPV，sPD-1，sPD-L1 联合模型对ITP 治疗疗效预测的曲线下面积为0.849（95%CI：0.811～0.886），高于MPV，sPD-1，sPD-L1 单一指标检测0.760（95%CI：0.719～0.801），0.699（95%CI：0.660～0.737），0.747（95%CI：0.709～0.785），差异具有统计学意义(Z=3.029，3.690，2.789；P=0.003，0.000，0.015)。

图1 ROC 曲线分析血清MPV，sPD 1，sPD L1 及联合模型对ITP 治疗疗效的预测价值

表4 血清MPV，sPD 1，sPD L1 及联合模型对ITP 治疗疗效的预测价值

3 讨论

目前糖皮质激素是ITP 的一线治疗方案，但约20%～30%的ITP 患者对糖皮质激素治疗无效，病程迁延反复可进展为慢性或难治性ITP[8]。深入研究ITP 疾病机制，对于ITP 的临床治疗及预后评估具有重要意义。ITP 是一种获得性免疫系统异常疾病，涉及T 细胞、B 细胞等功能障碍，CD4+T 细胞参与B 细胞的分化和成熟，其过度激活参与促进ITP 的发生发展[9]。T 细胞的激活不仅需要T 细胞受体识别抗原提呈细胞表面的抗原肽-MHC 复合物的第一信号系统，还需要PD-1/PD-L1 等通路介导的负反馈调节。PD-1/PD-L1 途径的持续激活可导致效应T 细胞衰竭和功能障碍，防止过度的免疫损伤，并在维持免疫稳态中发挥重要的调节作用[10]。因此，PD-1/PD-L1 通路中相关靶点可能是影响ITP发生发展的重要生物标志物。

PD-1/PD-L1 信号通路是T 细胞活化负调控的重要机制之一，该通路的异常激活或失活在人类恶性肿瘤、多发性硬化、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等疾病的发生发展中发挥重要作用[11]。PD-1 和PD-L1 有分泌型和膜结合型。sPD-1 可通过特异性结合PD-L1 阻断PD-1/PD-L 信号传导，而sPD-L1 可通过其免疫球蛋白可变区结构域结合PD-1，抑制PD-1/PD-L1 信号传导途径，促进T 细胞增殖和活化[12]。WU 等[13]报道,ITP 患者外周血PD-1+CD3+CD4+T 细胞和PD-L1+HLA-DR+CD11c+树突状细胞比例明显高于对照组，可早期鉴别诊断ITP。本研究中ITP 组患者血清中sPD-1，sPD-L1水平升高,与WU 等[13]在ITP 患者外周血单个核细胞中PD-1，PD-L1 表达上调一致，而本研究在血清sPD-1，sPD-L1 蛋白水平进行检测，结果更为准确。本研究中sPD-1，sPD-L1 表达升高较既往研究报道[13]升高更为明显,分析其原因，一方面是本研究纳入ITP 患者中重度患者达65 例，因而血清sPD-1，sPD-L1 蛋白水平明显较高。另一方面可能与不同研究病例的纳入标准不同及样本量不同等因素有关。本研究中，ITP 患者血清sPD-1，sPD-L1的表达与PLT 呈负相关，提示血清sPD-1，sPD-L1水平有助于反映ITP 患者疾病严重程度。分析其原因，正常生理状态下PD-1/PD-L1 通路的激活能够诱导效应性T 淋巴细胞的耗竭及功能丧失，抑制过度的自身免疫损伤，维持免疫稳态。而当血清sPD-1，sPD-L1 水平升高时，两者能够结合并阻断PD-1/PD-L1 通路，机体免疫耐受的丧失，Th1 型和Th2 型细胞平衡失调，机体发生过度的自身免疫反应，导致ITP 的发生发展。研究证实，sPD-1，sPD-L1 阻断PD-1/PD-L1 通路能够结合Th17 细胞表面的相应受体，促进白介素17 等炎症因子的释放，效应T 淋巴细胞过度增殖和活化，导致ITP 等自身免疫性疾病的发生[13-14]。LI 等[15]发现，利用特异性PD-1 抗体体外处理ITP 患者外周血单个核细胞48h 后，能显著促进外周血单个核细胞干扰素γ 的释放，干扰素γ 不仅能够诱导Th0 细胞向Th1 细胞分化，促进CD4+效应性T 细胞的活化增殖，还能够抑制Th2 型细胞分化，导致Th2 型细胞因子白介素4，白介素10 及转化生长因子β 分泌减少，B 细胞分泌产生大量抗血小板抗体，导致血小板免疫性破坏增加。因此，ITP 患者血清sPD-1，sPD-L1 水平升高与疾病严重程度有关，可能是新的ITP 血清生物标志物。但血清sPD-1，sPD-L1水平是否有助于评估ITP 治疗疗效尚不清楚。

本研究中，血清sPD-1，sPD-L1 升高是影响ITP治疗疗效的独立危险因素，提示sPD-1，sPD-L1 是影响ITP 患者激素治疗疗效的重要因素。分析其原因，一方面是sPD-1，sPD-L1 升高能够促进CD4+T细胞亚群的活化和增殖、调节性T 细胞数目降低、Th17 细胞数目升高、调节性T 细胞/Th17 细胞亚群比例平衡失调、白介素-17 和干扰素-γ 大量分泌产生，诱导Th0 向Th1 细胞分化，加重自身免疫反应，体外实验中进一步证实，地塞米松激素治疗不能抑制Th17 细胞的增殖，该CD4+T 细胞亚群对皮质类固醇治疗无反应，导致ITP 患者对激素治疗无效[16-17]。另一方面，高剂量地塞米松治疗能够通过促进ITP 患者髓源性抑制细胞的功能，抑制自身免疫损害。研究发现，sPD-1，sPD-L1 能够通过抑制髓源性抑制细胞线粒体中脂肪酸氧化限速酶肉碱棕榈酰转移酶-1 的表达，引起线粒体有氧代谢受损，髓源性抑制细胞表面糖皮质激素受体表达降低，导致ITP 患者糖皮质激素耐药性的发生[18-19]。因此，血清sPD-1，sPD-L1 升高可能是ITP 治疗反应较差及疾病反复的原因之一。

MPV 是血小板的平均体积，能够反映骨髓巨核细胞的增生、代谢及PLT 生成情况。本研究中ITP 患者MPV 升高，提示ITP 患者外周PLT 破坏增加，而在病例对照组，由于化疗等因素导致骨髓抑制,MPV 减小。本研究结果显示，治疗有反应组MPV 大于无反应组，提示MPV 是影响ITP 患者糖皮质激素治疗疗效的影响因素，与既往研究报道一致[20]。其原因是糖皮质激素刺激骨髓巨核细胞释放血小板，大量不成熟血小板释放入血导致MPV 变大，而MPV 越大，其内部血小板细胞器增加，代谢和功能更为活跃。但本研究并未观察到骨髓巨核细胞数目之间的差异，分析其原因，可能是激素敏感性受多因素的影响，如不同ITP 患者存在不同的基因或通路的异常改变等[18]，有待今后进行深入研究。本研究中，基于MPV，sPD-1，sPD-L1 建立的联合模型在预测ITP 患者治疗反应的曲线下面积为0.849，预测的敏感度和特异度分别为0.752，0.801，提示该模型具有较高的诊断效能，高于既往研究报道结果[21]，这与不同选择的预测因素不同有关。临床医师可利用该预测模型，在治疗前对患者对激素治疗的反应进行预测，从而选择最佳治疗药物，缩短患者血小板持续低下的时间，降低出血风险。

综上所述，血清sPD-1，sPD-L1 水平升高与ITP 的发生发展相关,MPV，血清sPD-1 和sPD-L1是影响ITP 治疗疗效的独立因素。通过构建sPD-1，sPD-L1 和MPV 的联合模型有助于评估ITP 患者的治疗疗效,具有一定的临床应用价值。但本研究也存在不足之处，本研究未对ITP 中其他调控T 细胞功能的细胞因子和通路进行检测，有待今后进行深入的临床及实验研究进一步验证。