脂肪变性供肝冷缺血损伤的研究进展

杨汉文 王强 成柯 蔡铭心 赵于军

美国专家Starzl 教授于20世纪60年代实施了第1 例人体原位肝移植，为人类器官移植掀开了崭新的一页[1]。随着社会的发展，移植手术的需求日益增多，但因器官的供应不足而受限。为了缓解这种情况，许多移植中心被迫扩大器官选择标准。鉴于非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）供者比例日益增多，如何提高脂肪变性供肝的使用率至关重要[2]。脂肪变性根据脂肪泡的大小分为大泡性脂肪变性和小泡性脂肪变性，大多数情况下大泡性脂肪变性和小泡性脂肪变性同时存在于不同程度脂肪变性的肝脏中[3]。脂肪变性根据脂肪浸润严重程度分为轻度（＜30%）、中度（30%～60%）和重度（＞60%）。在临床上，小泡性脂肪变性、轻中度的大泡性脂肪变性供肝可应用于肝移植[4-5]。临床器官移植前需要将供者器官进行冷保存，此过程经历的低温、缺血以及缺氧造成的细胞凋亡、酸中毒等病理损伤称为冷缺血损伤[6-7]。冷缺血损伤增加了肝移植术后器官功能不全的发生率，因此了解脂肪变性供肝冷缺血下的损伤机制和干预措施尤为重要。据笔者查阅文献，已有的脂肪变性供肝相关研究大多为热缺血-再灌注损伤和肝移植术后的研究，但尚无冷保存阶段的文献阐述，本文对脂肪变性供肝冷缺血损伤的相关研究做一综述。

1 脂肪变性供肝冷缺血下的功能评估

Young 等[8]使用MRI 评估供肝的质子密度脂肪分数，即评估供肝脂肪变性程度，这是首次用MRI评估离体供肝的研究，但结果的准确性依赖于机器温度的校准。Hamamoto 等[9]发现器官保存期间灌注液的游离脂肪酸和乳酸脱氢酶能够反映供肝质量，当游离脂肪酸达到45 μg 时，提示肝脏损伤不可逆。Cardini 等[10]发现，相比苏木素-伊红染色法，聚合酶链反应、实时共焦显微镜更能反映脂肪变性供肝冷保存早期的功能状态，能准确检测不同冷缺血时间下的肝细胞活性，但其局限性是对炎症细胞的敏感性不高。

微透析技术是一种将灌洗和透析技术结合，能够连续微量取样的技术，可监视细胞代谢及组织受损的情况[11-12]。随着冷缺血时间的延长，脂肪变性供肝大鼠透析液葡萄糖水平降低，脂肪变性供肝的缺血缺氧损伤程度逐渐加重，因此推测微透析技术对肝移植术前脂肪变性供肝功能评估具有重要意义，值得深入探讨[13]。

2 脂肪变性供肝冷缺血损伤的机制

2.1 不同冷缺血保存方式的比较

冷缺血保存通常包括体外静态冷保存（static cold storage，SCS）和体外机械灌注。机械灌注根据温度的不同分为常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）、低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP） 和亚低温机械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）3 类[14-15]。SCS 的主要优点是方便、价格低廉，但对器官的保护作用不如HMP。HMP 在临床较为常用，其主要优点是可以评估器官功能，有改善氧合、抗氧化、改善微循环等作用，但其费用昂贵[16-17]。Wang 等[18]发现，相比脂肪变性供肝SCS 组，脂肪变性供肝HMP 组的brahma 相关基因（brahma-related gene 1，Brg1）、核因子E2 相关因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）和血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1 的蛋白表达水平更高，同时凋亡程度、炎症指标水平更低，提示HMP 可能通过Brg1/Nrf2/HO-1 通路抑制凋亡和炎症反应。

2.2 冷缺血损伤的相关细胞器

为了检测冷缺血损伤中细胞膜的完整性，Taneja等[19]将台盼蓝溶液加入灌注液中，判断肝脏损伤情况。在30 min 时，脂肪变性供肝和正常肝脏的肝细胞、肝血窦内皮细胞的台盼蓝摄入量差异无统计学意义；在24 h 时，脂肪变性供肝的肝细胞台盼蓝摄入量远大于正常肝细胞，而肝血窦内皮细胞差异无统计学意义，且损伤指标远远高于正常肝脏，表明在脂肪变性供肝中肝细胞更易受到冷缺血损伤。

肝细胞冷缺血损伤通常表现为细胞器损伤，如线粒体、溶酶体、内质网等。线粒体是一种双层膜的细胞器，外层膜决定了线粒体的体积，包含了线粒体融合和分裂蛋白，内层膜上有呼吸链等重要结构。Tolba 等[20]发现，在组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液（histidine-tryptophan-ketoglurate solution，HTK 液）中加入左旋肉碱后线粒体谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）增多，肿胀程度减轻，线粒体基质、线粒体嵴较前清晰，表明左旋肉碱对线粒体具有较好的保护作用。Chu 等[21-22]发现，与正常肝脏比较，脂肪变性供肝线粒体复合物Ⅰ的活性改变导致其线粒体功能障碍，因此更易受冷缺血损伤。缺血预处理可以改善轻度脂肪变性供肝的线粒体功能，但对中、重度脂肪变性供肝无明显效果。该学者进一步发现线粒体复合体Ⅰ的活性于冷保存5 h 开始减弱，且磷酸化程度远低于正常肝脏，这个时间节点的提出对脂肪变性供肝冷保存的干预具有指导意义。Abudhaise 等[23]发现在4 h 的HMP 后肝脏线粒体呼吸链的结构依然完整，且相比高质量的肝脏，低质量的肝脏在4 h 的HMP 灌注后线粒体呼吸链复合体Ⅱ、Ⅲ的活性下降幅度更大，提示复合体Ⅱ、Ⅲ可作为肝功能评估的重要指标。Minor 等[24]对肝脏腔静脉进行低浓度氧气灌注后，实验组中线粒体自噬蛋白beclin-1 的表达增加，线粒体GLDH 释放减少。因此，线粒体损伤是冷保存损伤的重要特征，包括线粒体形态、呼吸链和自噬功能等损伤。

溶酶体是真核细胞内发挥降解作用的细胞器。相关研究表明，肝脏脂肪变性与溶酶体的通透性有关。溶酶体蛋白酶Cathepsin 包括11 种，其中Cathepsin B是较重要的一类。凋亡可引起溶酶体分泌Cathepsin，释放分解后进入胞浆激活凋亡途径，从而引发肝损伤[25-27]。Guicciardi 等[27]发现，与对照组相比，Cathepsin B 敲除的脂肪变性供肝小鼠，凋亡程度指标细胞色素C 和肝损伤指标肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 明显减少，冷缺血损伤减轻。因此，抑制Cathepsin B 可能减轻脂肪变性供肝的冷缺血损伤，未来值得深入探讨。

内质网是蛋白质加工的主要场所。当细胞外理化因素改变时，未折叠蛋白的积累引发内质网应激。内质网激活细胞内信号传导通路被称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）[28]。UPR 易引发细胞的凋亡与自噬，通常由转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、肌醇酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）和蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）3 种跨膜蛋白介导[29-30]。这些跨膜蛋白可抑制过量的蛋白进入内质网，同时促进内质网的蛋白进入胞浆以进行泛素化，最终被泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解[31]。有研究证实，抑制UPS 能够抑制肝脏冷缺血期间泛素化蛋白的降解，从而延长保存时间[32]。

3 脂肪变性供肝冷缺血损伤相关通路及干预措施

在脂肪变性供肝冷缺血状态下，多种蛋白通过上述细胞器发挥着保护性作用。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monphosphate activated protein kinase，AMPK）、乙醛脱氢酶2 （aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）和HO-1 是脂肪变性供肝冷缺血损伤通路中的3 类重要蛋白。

3.1 AMPK 及其相关通路

AMPK 广泛存在于真核生物中，主要功能是促进细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成，减少ATP 消耗[33]。Panisello-roselló 等[34]发现Institute Georges Lopez（IGL）-1 溶液含有较高的AMPK 成分，可通过抑制UPS 减轻冷缺血损伤。Zaouali 等[35]进一步证实了较低剂量的UPS 抑制剂MG132 和硼替佐米对冷缺血状态下脂肪变性供肝的保护作用。硼替佐米主要机制是激活AMPK/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路，而MG132 的作用则需进一步探讨。Zaouali 等[36]在IGL-1 溶液中加入褪黑素和曲美他嗪发现，通过激活AMPK，降低了内质网应激蛋白的表达，增加了自噬蛋白的表达，从而减轻脂肪变性供肝冷缺血损伤。Ben Mosbah 等[37]发现卡维地洛也可通过AMPK/eNOS 通路减轻脂肪变性供肝冷缺血损伤。综上所述，IGL-1 溶液中的AMPK 主要通过激活eNOS 发挥作用，但上游通路需进一步探讨。碳酸酐酶是普遍存在的锌金属酶，有多种亚型，可催化可逆反应二氧化碳的水化，形成碳酸氢盐和1 个质子[38]。为了探讨其在器官保护方面的作用，Bejaoui 等[39-40]在IGL-1 溶液中加入碳酸酐酶，碳酸酐酶组再灌注后AMPK 蛋白表达显著上调，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）应激指标明显减少。乙酰唑胺是碳酸酐酶的特异性抑制剂，该学者将乙酰唑胺加入上述模型中，发现乙酰唑胺能通过抑制MAPK 减轻脂肪变性供肝的冷缺血损伤。

3.2 ALDH2 及其相关通路

ALDH2 是一种广泛表达的线粒体酶，在肝脏中高表达[41]。Panisello-Roselló 等[42]发现ALDH2 能够抑制转氨酶的释放，减轻脂肪变性供肝冷缺血损伤，因此推测ALDH2 是一个潜在的治疗靶点。Bardallo等[43]发现IGL-2 溶液中的聚乙二醇35 可增加脂肪变性供肝ALDH2 的表达，从而减轻冷缺血损伤。

3.3 HO-1 及其相关通路

HO-1 是一种氧化应激诱导酶，能够催化血红素的降解[44-45]。Kim 等[46]在酒精性脂肪变性供肝模型中发现，与对照组比较，HO-1 组胆汁分泌增加，氧化反应程度指标丙二醛减少，因此HO-1 在酒精性脂肪变性供肝冷保存中具有保护作用，未来仍需探讨在非酒精性脂肪变性供肝模型中的作用是否一致。Zaoualí 等[47-48]发现，褪黑素能通过激活HO-1 和eNOS 减轻脂肪变性供肝线粒体损伤，减少氧化应激反应。该学者还发现在IGL-1 溶液中加入曲美他嗪也能促进HO-1的表达，减轻脂肪变性供肝的冷缺血损伤。褪黑素和曲美他嗪可能通过AMPK 和HO-1 蛋白保护上游细胞器。

4 小结

综上所述，由于供脏短缺，大量的脂肪变性供肝用于肝移植。相比于正常肝脏，脂肪变性供肝的肝细胞更易受冷缺血损伤。肝细胞的损伤通常表现为细胞器如线粒体、内质网、溶酶体的损伤。硼替佐米、卡维地洛、聚乙二醇35、褪黑素等可通过激活AMPK、HO-1、ALDH2 等蛋白，保护冷缺血状态下脂肪变性供肝的功能。eNOS 可能是AMPK、ALDH2和HO-1 的共同上游蛋白，保护线粒体等细胞器的功能。未来仍需进一步探讨eNOS 作用于细胞器的具体靶点以及相关通路。脂肪变性供肝冷缺血损伤机制尚不明了，未来仍需进行深入细致的探究。