巨噬细胞在移植后慢性排斥反应中的作用研究进展

任滌非 廖涛 苗芸

慢性排斥反应（chronic rejection，CR）主要在器官移植术后6 个月后发生，长期CR 引起的不可逆损伤可能导致移植物失功[1]。最新研究表明，器官移植为激活先天免疫提供了理想的环境，巨噬细胞被认为是触发CR 的关键细胞。器官移植术后，不同亚群的巨噬细胞通过吞噬坏死细胞、分泌促炎因子、诱导组织修复等方式，动态性地促进或抑制CR[2-3]。深入挖掘巨噬细胞在CR 中的作用和机制，对于器官移植受者治疗创新策略的发展至关重要。本文通过概述不同亚群巨噬细胞在CR 中的作用机制，总结近年巨噬细胞相关疗法的研究进展，为今后有关巨噬细胞及CR的研究提供参考。

1 CR 的主要病理变化

各类器官移植术后CR 在病理上的共同表现包括炎症及组织中空结构的纤维化和闭塞[4]。不同器官的CR 也有其特殊的病理变化。肾移植CR 主要表现为持续性的微血管炎症、移植肾增生性肾小球病变及肾小管萎缩[5]；肝移植CR 最主要的两个组织学特征是胆管缺失综合征和大中型动脉的闭塞性动脉病变[6]；心脏移植术后CR 会导致心脏移植物血管病变和心脏间质纤维化，继而引发心肌梗死和舒张障碍等并发症[7]。

2 参与CR 的巨噬细胞多样性及功能差异

2.1 表型的多样性及功能差异

参与CR 的巨噬细胞主要包括由休眠状态的巨噬细胞极化而来的M1、M2 亚型和一些独立亚型。M1型巨噬细胞通常由干扰素（interferon，IFN）-γ 等辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1 分泌的细胞因子诱导极化而来，其通过分泌白细胞介素（interleukin，IL）-6 等促炎因子维持炎症反应，还会释放大量诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）2 并在局部积聚，诱导CR。移植物被M1型巨噬细胞损伤后会释放大量损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP），进一步诱导M0 型向M1 型极化[3,8]。

M2 型巨噬细胞主要由Th2 分泌的细胞因子诱导而来，有抗炎功能，在CR 中参与组织修复、血管生成，影响纤维化进程[9]。该亚群还可分出4 类子亚群，其中，M2a 型主要起组织重塑和损伤修复的作用，M2b型可调节免疫并抑制M1 型极化，M2c 型可清除凋亡细胞，M2d 型能促进血管生成并诱导肿瘤发展[10]。

调节性巨噬细胞（regulatory macrophage，Mreg）是一种多来源的独立巨噬细胞亚型。研究表明，用IgG 免疫复合物及脂多糖刺激骨髓源性巨噬细胞，用肾上腺素、脂肪源性主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）使M0 型巨噬细胞极化，诱导M1 型巨噬细胞中环磷酸腺苷效应元件结合蛋白调节转录共激活因子[cyclic adenosine monphosphate response element-binding protein（CREB）-regulated transcription coactivator，CRTC]3的去磷酸化，都可以促进巨噬细胞转化为Mreg。Mreg 可高表达MHC Ⅱ及CD80，在抗原提呈过程中起重要作用。此外，Mreg 还能分泌高水平的IL-10 和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β等免疫抑制因子，并抑制CD8+T 细胞和CD4+调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）增殖，对于移植后排斥反应中免疫抑制、免疫耐受的形成意义重大，在CR 的治疗上具有巨大的潜在价值[11-12]。

M（IL-23）型巨噬细胞由IL-23 诱导而成，主要表达IL-17A、IL-22 和IFN-γ[13]。且巨噬细胞表型具有动态性，例如，在间充质干细胞等条件的诱导下，M1 型可以被诱导为M2 型[14]。

2.2 来源的多样性及功能差异

参与CR 的巨噬细胞来源于全身不同组织。传统的巨噬细胞由骨髓源性髓样前体细胞发育而来，参与血液循环。此外，大多数组织胚胎期就开始存在以M2 型为主的驻留巨噬细胞，几乎不参与血液循环，主要通过自我更新来补充数量，如破骨细胞、枯否细胞和小胶质细胞[15-16]。当组织损伤时，循环中的巨噬细胞也可以被募集到相应组织或器官中。驻留巨噬细胞以及从外周循环募集来的巨噬细胞在CR 中发挥不同作用。以肝脏为例，在肝移植术后缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）导致的CR 中，驻留在肝脏的枯否细胞通过识别IRI 应激细胞释放的DAMP，释放趋化因子来募集免疫细胞并诱导组织修复。募集来的巨噬细胞中，腹腔巨噬细胞可进行组织修复，脾源性巨噬细胞除组织修复外还有抗炎作用，而骨髓源性巨噬细胞却会促进炎症、血管生成及肝脏纤维化[17]。受肝窦内皮细胞和肝细胞表达的“Kupffer细胞增强子”影响，募集巨噬细胞可以通过特异性重构，获得驻留巨噬细胞的功能[18-19]。

3 巨噬细胞参与CR 的作用及机制

3.1 不同组织CR 中巨噬细胞优势亚群的差异

不同组织的CR 中，巨噬细胞优势亚群的种类和细胞数量不尽相同。有研究显示，在同种异体肾移植小鼠模型从急性排斥反应向CR 发展的过程中，Ly6cloMrc1+型和Ly6cloEar2+型等对IFN-γ 反应弱的巨噬细胞数量显著增长[20]。有研究表明，慢性抗体介导的排斥反应（chronic antibody-mediated rejection，cAMR）受者肾活组织检查样本的肾小球中，68%的巨噬细胞为M2 型巨噬细胞，而肾小管间质区域中，61%的巨噬细胞为M1 型巨噬细胞[21]。还有研究证明，与T 细胞介导的排斥反应和急性抗体介导的排斥反应相比，cAMR 中M2 型巨噬细胞在肾小球中浸润程度更高[22]。另一项研究表明，在心脏移植术后由急性排斥反应转向CR 的过程中，心实质内的巨噬细胞优势亚群由M2 型转变为M1 型，而在心间质中，优势亚群的巨噬细胞则是由M1 型转变为M2 型[23]。

3.2 巨噬细胞与CR 导致的移植物血管病

移植物血管病（graft vascular disease，GVD）主要表现为血管内膜向心性增生和进行性血管狭窄，最终导致移植物缺血。有研究者将卡拉胶应用于异种心脏移植小鼠，在保全其他免疫细胞的情况下消耗了30%～80%的巨噬细胞，使GVD 的发生率降低了约70%，而联合使用细胞毒T 淋巴细胞相关抗原4-免疫球蛋白（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4-immunoglobulin，CTLA4-Ig）和M2 型巨噬细胞极化抑制剂P2×7R 也可预防GVD，并提高移植物存活率，表明M2 型巨噬细胞在CR 中有重要作用[24-25]。此外，M1 型巨噬细胞可以通过表达iNOS 加重GVD，该过程受IFN-γ 调控[26]。

同种异体心脏移植术后，多种巨噬细胞会被诱导表达CXC 趋化因子受体（CXC chemokine receptor，CXCR）1 并产生趋化因子CX3CL1，将外周巨噬细胞募集到移植物血管，使内皮平滑肌细胞过度增生而导致血管壁增厚、血管阻塞，进而发生GVD。外周巨噬细胞的趋化运动依赖于细胞骨架中由肌动蛋白构成的微丝，而肌动蛋白受Rho GTP 酶等多种因素调节[27]。Rho GTP 酶中的RhoA 缺失时，巨噬细胞会减少CX3CL1 受体的表达而无法感知信号，抑制RhoA还会使肌动蛋白依赖的局部黏附物在伪足尖聚集，拉长巨噬细胞[28]。此过程具有亚群特异性，成熟M1、M0、M2 型巨噬细胞长度变化依次增大[29]。

部分巨噬细胞亚群能起到减轻IRI 的作用。在肝脏发生IRI 时，其驻留巨噬细胞会产生血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1 降解溶血过程中释放到红细胞外的血红素，以避免氧自由基的产生，减轻CR产生的GVD。移植前HO-1 低表达的患者预后更好，而移植后HO-1 低表达的患者临床结果更差[30]。

3.3 巨噬细胞与CR 导致的移植物纤维化

CR 过程中，血管移植物小动脉内膜下的成纤维细胞受移植后慢性损伤刺激，产生了过量的细胞外基质。基质在内膜下积聚，导致了移植物纤维化。CR在移植术后机体促纤维化、抗纤维化因素的失衡上有重要作用。同种异体肾移植术后CR 中，纤维化面积与M2 型巨噬细胞数量呈高度正相关[31]。M2 型巨噬细胞通过产生TGF-β1 和血管内皮生长因子缓解组织炎症，但也促进了组织纤维化[32]。一些研究对临床上CR 受者的肾活组织检查样本和异种移植术后CR小鼠肾组织样本进行分析，发现在CR 导致的进行性肾纤维化过程中，骨髓源性巨噬细胞亚群（以M2 型巨噬细胞为主）可以通过巨噬细胞-肌成纤维细胞转换过程，转化为肌成纤维细胞。此种转换细胞可以共表达巨噬细胞标志物（F4/80 或CD68）和α-平滑肌肌动蛋白，其数量约为肌成纤维细胞总数的50%，与移植物功能和肾间质纤维化的严重程度密切相关。该过程受TGF-β/Smad3 信号调节[33]。心脏移植术后，移植物内产生大量促炎因子高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1），促进其成纤维细胞和巨噬细胞释放活性TGF-β1，进而加速Smad2 和Smad3 的磷酸化而导致移植心脏纤维化[34]。有研究通过分析小鼠肾移植CR 发生前后表达的微小RNA（micro RNA，miRNA，miR），发现与纤维化相关的miR-21a-5p 明显上调。巨噬细胞中成熟的miR-21a-5p 经囊泡分泌后被肾成纤维细胞内化，可以起到促纤维化和促炎症作用[35]。

另外，一些巨噬细胞亚群可以减缓纤维化进程。有研究通过细胞特异性敲除实验证明，在小鼠心脏移植中，清除供体来源以M2 型为主的驻留巨噬细胞会加剧移植物的纤维化，这可能是因为驻留巨噬细胞吞噬坏死细胞并通过释放IL-10 等免疫抑制因子阻碍了移植物中T 细胞的增殖和激活[36]。该实验证明了供体来源的驻留巨噬细胞对同种异体移植物纤维化有保护作用。

4 巨噬细胞相关CR 的治疗

近年巨噬细胞相关CR 治疗的研究逐渐增多，但目前仍主要局限于细胞及动物实验中[37-38]。通过抑制巨噬细胞中RhoA 和肌动蛋白的结合来阻止巨噬细胞进入移植器官，有可能阻止CR 的发生[39-40]。研究表明，有RhoA 缺陷的小鼠接受心脏移植后，巨噬细胞的CX3CR1/CX3CL1 信号明显下调，巨噬细胞浸润、血管闭塞被抑制，GVD 发生率显著下降[41]。法舒地尔等多种RhoA 抑制剂也对CR 有抑制作用。有研究证实，在小鼠或大鼠心脏移植术后1 周内给予受体3～4 次RhoA 抑制剂，可以消除其CR[28，42]。

对miR-21a 进行基因沉默可能对CR 有抑制作用。同种异体肾移植术后对小鼠miR-21a-5p 基因进行治疗性沉默，可以明显减少肾组织纤维化，改善其慢性肾移植排斥反应[35]。也有研究发现对心脏移植小鼠使用miR-21 特异性拮抗剂，可抑制M1 型巨噬细胞的糖酵解，进而抑制相关炎症反应，降低慢性GVD的发生率，并提高了移植小鼠的存活率[43]。

IL-33 可限制浸润巨噬细胞促炎能力而抑制CR。研究发现，当小鼠心脏移植术后缺乏IL-33 时，M1型巨噬细胞会在局部释放更多iNOS，加速移植物丢失，而局部输送IL-33 可以促进巨噬细胞中与修复和调节相关的代谢程序，预防CR[8]。抑制同种异体移植受体的IL-33 受体ST2，也能加剧CR 导致的GVD和纤维化，这主要反映了IL-33/ST2 信号对受体炎症细胞浸润的影响；而抑制供体的ST2 却能减轻症状，这反映了信号对移植物驻留细胞的影响[44]。

5 小结与展望

本文概述了不同亚群的巨噬细胞参与不同器官移植术后CR 的机制及功能多样性。参与CR 的巨噬细胞主要分为M1 型、M2 型和一些特殊的独立表型，来源上主要分为外周巨噬细胞及驻留巨噬细胞。在CR 产生的GVR 及纤维化过程中，这些巨噬细胞动态性地发挥了抗CR 及促CR 的作用。

作为独立于传统分型，且具有免疫抑制功能的巨噬细胞亚群，Mreg 在CR 中具有巨大的潜在治疗价值。我们期待Mreg 的诱导方法能在将来得到改良，以增强细胞产量及免疫抑制能力。研究者们还可以通过动物实验等方式，筛选出与Mreg 适配的免疫抑制药，以加强相关治疗方案的抗排斥反应效果，为今后的临床试验提供参考。驻留巨噬细胞的清除会加剧移植物纤维化，但目前对该现象的机制解释停留在猜想层面，并未进行进一步实验。未来应完善该机制，以证实驻留巨噬细胞在CR 治疗中的潜在价值。此外，巨噬细胞在CR 中依赖于肌动蛋白的募集过程很可能与昼夜节律对免疫细胞的调节作用相关。目前，针对该过程的研究进展缓慢，这应该是节律相关分子标志物的空缺而导致的。近年来，生物信息学及图像分析技术发展迅速，有助于研究者们深入探究CR 中巨噬细胞的募集过程和生物节律的关系。虽然先天免疫在CR 中的作用逐渐得到重视，但现有的资料仍认为，适应性免疫在CR 进展中起主导作用。巨噬细胞也通过多种途径，在CR 中影响适应性免疫而间接起到作用。巨噬细胞参与CR 的机制与适应性免疫间的联系在将来依然值得进一步研究。