无创DNA检测13-三体高Z值假阳性病例1例分析

高旭,王清冰,陈义兵

(郑州大学第一附属医院 妇产科遗传与产前诊断中心,河南 郑州 450000)

无创产前DNA检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)主要应用于孕期产检筛查,其基本原理是提取孕妇外周血中的全部游离DNA进行高通量测序,然后和数据库中的人类基因组DNA进行比对。如果胎儿的21号、18号或13号染色体明显升高,则预示胎儿有患21-三体、18-三体、13-三体的风险;如果正常,则提示NIPT阴性。由于NIPT仅作为筛查工具,存在假阳性和假阴性,因此不能作为诊断的依据。本文通过1例13-三体高Z值假阳性病例分析,显示侵入性产前诊断对于明确诊断仍具有不可替代的价值,即使很高的Z值仍可能为假阳性结果。

1 病例介绍

孕妇31岁,孕18周,孕次2产1次,无不良孕产史,家族遗传史阴性,中孕期血清学筛查提示临界风险,遂到郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心就诊。在充分了解无创产前检测(non- invasive prenatal testing,NIPT)优点及风险后,孕妇书面签署知情并同意行NIPT。采集孕妇10 mL静脉血,于8 h内1 600g4 ℃离心10 min,所得上清液再于16 000g4 ℃条件离心10 min,取上清液于-80 ℃冻存。参考本中心成熟技术制备样本DNA,经检测合格后制备DNA文库并生成测序簇,利用贝瑞和康NextSeq CN500测序平台行36 bp单端高通量测序,测序深度为0.66倍的高通量测序[1]。将测序所得序列与人类基因组参考序列(hg19)在BWA map软件上进行比对,所得结果再利用自有软件BGPD v2.0.1统计每条染色体序列个数,计算每条染色体占比(%chrN),并得出其Z值,其阳性切值为±3。结果显示胎儿13号染色体Z值为19.18,提示患13-三体风险高。孕妇因此再次来院就诊咨询,在充分知情并了解风险后,孕妇签署知情同意书行侵入性产前诊断,取羊水样品进行染色体核型和拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析。孕妇于孕19周在无菌条件下行羊膜腔穿刺取样术,所得样品利用常规方法制备染色体G显带标本,成功后进行镜下染色体核型分析,按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN-2009)标准描述核型。运用贝瑞和康公司的CNV检测(CNV sequencing,CNV-seq)试剂盒经过提取胎儿细胞基因组DNA和建库测序并进行后续生物信息学分析,应用DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk/)、DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/)、OMIM(https://www.omim.org/)等在线数据库,结合本中心的内部数据对结果进行解读[2]。羊水染色体核型分析提示胎儿核型为46,XN,见图1,未见核型异常。CNV-seq技术对胎儿羊水细胞DNA 进行分析,结果提示seq[hg19]46,XN,见图2,未见基因组拷贝数异常。

图1 患者染色体核型结果

图2 患者CNV-seq结果

2 讨论

自1997年香港中文大学卢煜明教授在孕妇外周血中发现胎儿游离DNA并开发出相应技术用以筛查胎儿染色体非整倍体风险以来[3],NIPT已在我国临床实践中广泛用于筛查胎儿染色体非整倍体风险,其对13-三体、18-三体和21-三体均具有较好的检测灵敏度和特异度[4]。然而NIPT仍然只是筛查性检测,其结果可能与产前诊断结果不符[5]。NIPT提示非整倍体或其他异常核型为高风险(结果阳性),但侵入性产前诊断报告胎儿染色体正常的情况称为NIPT假阳性。与假阴性结果相比,假阳性结果更为常见,而孕妇对阳性结果往往又非常焦虑。NIPT假阳性发生的原因有多种,主要包括孕妇本人染色体异常、限制性胎盘嵌合、DNA拷贝数异常、双胎、胎儿游离DNA水平过低以及孕妇肿瘤等因素。NIPT虽能够准确检测孕妇外周血游离DNA总浓度的变化,但对其变化来源却无法分辨。NIPT阳性病例往往具有较高的胎儿染色体异常检出率,但仍存在假阳性可能。孕妇外周血游离DNA大部分来源于母体,虽然其分离与纯化技术日益成熟且严格,但样本中仍会存在部分影响胎儿游离DNA检测的片段,这就可能会导致NIPT假阳性。胎盘的组织基因组大部分情况下与胎儿相同,而孕妇外周血游离胎儿DNA主要来源于胎盘滋养层细胞,因此理论上检测孕妇外周血胎儿游离DNA即可获得与胎儿组织相同的检测结果。然而,胎盘细胞有丝分裂过程中可能出现染色体不分离或重排,导致部分胎盘组织染色体数量或结构异常,这些染色体异常的细胞可与正常核型胎盘细胞嵌合在一起,造成胎盘限制性嵌合,其中异常染色体细胞释放的游离DNA可在NIPT中检测到,导致NIPT呈假阳性结果,但此时胎儿染色体依旧正常。双胎妊娠时,若其中一胎早期停育,死亡胎儿或胚胎细胞将发生凋亡并释放大量cfDNA到孕妇外周血中,在超声检查看不到死亡胎儿或胚胎的情况下仍可能有其cfDNA释放,导致NIPT筛查呈假阳性[6]。其他情况如染色体倒位、平衡易位等情况也可导致NIPT假阳性或假阴性,NIPT对这些染色体异常不敏感。另外,检测流程、分析算法和技术平台类型都可能影响阳性预测值和假阳性率。据统计,67%的NIPT假阳性病例无法明确原因[7]。国内一项146 958例NIPT研究统计显示,在23例13-三体假阳性中,3例有孕妇CNV正常变异(2例最终确诊),9例怀疑限制性胎盘嵌合(2例在产后胎盘中得到验证),另外12例无法明确原因[8]。因此,NIPT虽然是一种较好的染色体风险筛查技术,但不能取代传统的侵入性染色体产前诊断方法。通过羊膜腔穿刺术来检测孕妇的核型及微阵列检测来进行确诊仍具有重要价值。

13号染色体GC含量(鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)较低会导致测序数据偏倚,更易出现假阳性,致其阳性预测值较低[8]。13-三体的胚胎或胎儿往往在妊娠早期即发生宫内死亡,这使得只有少数胎儿存活至中孕期筛查阶段[9]。另外13-三体发生率只有1/10 000,在大样本临床数据中也只有零星病例,致使所统计的阳性预测值和假阳性率也产生统计学偏倚,不同医疗机构所统计阳性预测值存在较大差异。就目前世界范围内NIPT临床实践来看,NIPT对13-三体筛查的阳性预测值普遍偏低,假阳性率普遍偏高。国内北京大学深圳医院分析了545例NIPT高风险孕妇数据,发现13-三体的阳性预测值为22%(9/41)[10],江西省妇幼保健院36 913名孕妇无创DNA检测结果显示13-三体的阳性预测值为41.94%(13/31)[11],吉林大学第一医院17 428例NIPT数据统计结果中13-三体的阳性预测值为33.33%(1/3)[12],宁波市妇幼保健院42 910例NIPT数据显示13-三体阳性预测值仅为13.79%(4/33)[13],常州市妇幼保健院57 204例NIPT数据显示13-三体的阳性预测值为18%～25%[14],南方医院统计41 819例NIPT发现13-三体阳性预测值为40%(6/15)[15],国内另一项统计146 958例NIPT数据显示13-三体阳性预测值为32.84%(22/45)[7],日本医科大学附属医院8 a 764例NIPT筛查中13-三体阳性预测值为50%(1/2)[16]。然而在国外一些早期NIPT研究中,可以看到13-三体的阳性预测值普遍高于60%,这可能与这些临床研究的都是高风险孕妇有关[17],日本55家医疗机构30 613例NIPT数据整合统计的13-三体阳性预测值为63.6%(28/50)[18]。Iwarsson等[19]的系统评价和meta分析研究表明,NIPT在普通孕妇群体中筛查21-三体的阳性预测值是80.8%(156/193),在高危孕妇中21-三体的阳性预测值是97.3%(1 839/1 891),足足提高了30倍。该研究还提示,NIPT在高危孕妇中13三体的阳性预测值是70.5%(134/190),但是该研究缺乏普通孕妇13-三体阳性预测值,但可以预见其在普通孕妇中阳性预测值会显著下降。Verweij等[17]指出NIPT筛查的阳性预测值依赖于其发病率,由于普通人群中13-三体发生率极低,对普通孕妇应用NIPT筛查13-三体时需要慎重。至于NIPT筛查Z值与阳性预测值的关系,目前研究尚无确定的结论。国内廖灿团队在214例NIPT高风险孕妇中分析了Z值与13、18、21三种染色体三体的相关性,logistic回归模型显示Z值与21、18-三体显著相关,但是与13-三体的相关性并不显著,ROC曲线分析也显示Z值预测对13-三体的预测效能不如21、18-三体,其中2例正常核型胎儿Z值大于20,其阳性预测值仅为28%(7/25),其中高Z值亚组的阳性预测值也只有46.15%[20]。遵义市妇幼保健院团队也分析了24 384例NIPT中假阳性情况,其中共有假阳性103例,13-三体假阳性15例[21]。本研究分析了Z值预测假阳性情况,发现Z值介于3～13时,阳性预测值只有14.3%(1/7),而当Z>13时,阳性预测值可达100%。可见,由于13-三体过低的发生率,NIPT筛查阳性和实际阳性病例均太少,缺乏足够的病例数量建立预统计效能良好的测体系,目前通过Z值大小并不能准确预测胎儿阳性情况。

3 结论

对于无创DNA筛查出现的13-三体高风险病例,侵入性产前诊断对于明确诊断仍具有不可替代的价值,即使很高的Z值仍可能为假阳性结果,充分告知孕妇相关知识也有利于缓解其焦虑情绪,改善诊疗依从性。