慢性间歇性低氧暴露对大鼠肝脏铁代谢的影响及机制研究

宋纪显, 陈 琦, 贾翠玲, 李博良, 张 智, 赵亚硕

(河北省中医药结合氢医学技术创新中心/河北中医学院, 河北 石家庄 050200)

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)是一种典型的呼吸系统疾病,最主要的病理特征是慢性间歇性低氧(Chronic Intermittent Hypoxia,CIH),可引起代谢紊乱及炎症反应等,造成多器官损伤[1]。有研究证实CIH可导致十二指肠、肝脏、脾脏等器官的铁代谢紊乱,但其具体机制尚不明确[2]。肝脏是调节铁代谢的重要器官,其分泌的hepcidin是调控铁稳态的主要物质,可参与铁的吸收、释放及利用[3],这主要依靠转铁蛋白-转铁蛋白受体1(Transferrin-Transferrin receptor 1,Tf-TfR1)、二价金属离子转运蛋白1(divalent metal-ion transporter 1,DMT1)、膜铁转运蛋白(Ferroportin 1,FPN1)及铁存储蛋白(Ferrtin)来实现[4]。研究表明hepcidin的表达受白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)等炎症因子的调节,而CIH暴露后可诱导大量炎症因子表达[5,6]。因此CIH暴露引起的炎症反应可能影响hepcidin的表达进而造成机体铁代谢失衡。故我们通过建立CIH大鼠模型,试图阐明CIH暴露影响hepcidin进而造成肝脏铁代谢紊乱的可能机制。

1 材料与方法

1.1动物:SPF级雄性SD大鼠(200±20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2016-0006,于河北中医学院科研中心动物中心进行饲养(动物伦理编号:DWLL2020044)。

1.2主要试剂与仪器:亚铁氰化钾(Sigma-Aldrich,货号:14459-95-1),血清铁、总铁结合力试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:A039-1-1、A040-1-1),DMT1(+ire)、DMT1(-ire)抗体(Alpha diagnostic international,货号:NRAMP21-S、NRAMP23-A),FPN1抗体(Alpha diagnostic international,货号:543233S5),TfR1抗体(Invitrogen,货号:13-6800),FTL抗体(Abcam,货号:ab109373),STAT3、p-STAT3抗体(Affinity,货号:AF6293、AF3294),β-actin抗体(Cwbiotech,货号:CW0096)、反转录试剂盒、定量试剂盒(Takara,货号:RR820A、RR047A),引物(Invitrogen),CIH氧舱(Oxyeycler Model 84,BioSpherix公司,美国)。

1.3动物模型和分组:在实验开始前,适应性饲养一周。将SD大鼠(n=20)随机分为常氧对照组(Normoxia)和模型组(CIH)。将模型组大鼠放置在动物间歇性低氧舱内,首先向舱内充入100% 氮气,使氧气浓度从21%降至5%,持续1.5min,后1.5min内向舱内充入100% 氧气使氧气浓度逐渐恢复到21%,每天8h,共35d(参考本课题组前期文献进行)[7]。对照组大鼠在间歇性低氧舱内充入空气,以保证其他环境条件一致。

1.4样本采集:造模结束后,采用腹腔注射 1% 戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉,通过股动脉采取大鼠血液。然后取大鼠肝脏,部分固定在 4%多聚甲醛,用于HE 染色、普鲁士蓝染色,部分放入冻存管内于-80℃长期保存,用于Western blot及Q-PCR检测。

1.5HE染色:采用HE染色观察肝脏的结构。将石蜡切片进行脱蜡,梯度酒精复水。然后进行苏木精染色、分化、伊红染色,之后梯度酒精脱水,封片。然后在显微镜下观察。

1.6血清铁、TIBC测定:血清铁,将血清铁与显色剂在100℃水中反应5min,离心后收集上清,在520nm处检测吸收值。TIBC测定,将标准铁(10mg/L)加入血清中室温反应5min,离心收集上清液。将上清液与铁显色剂混合,100℃反应5min,然后在520nm处检测吸收值。

1.7普鲁士蓝染色:切片脱蜡后用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS pH=7.4)清洗,然后用3% H2O2室温孵育20min,用PBS冲洗后于Perls’试剂中室温浸泡6h。然后DAB加强,苏木精染色,脱水,最后用中性树脂封片,显微镜下观察阳性细胞。

1.8Western blot:将肝脏组织裂解提取蛋白,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE将蛋白进行分离,然后转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶进行封闭后,孵育DMT1(+ire)、DMT1(-ire)、FPN1、TfR1、FTL、p-STAT3、STAT3、β-actin一抗4℃过夜。第2天TBST洗涤后,室温孵育相应二抗1h。最后,采用ECL法进行化学成像,采用Image J软件进行灰度值分析。

1.9Q-PCR:采用Trizol方法从肝组织中提取总RNA。取1μg RNA进行反转录提取cDNA。取40ng cDNA,加入基因特异性引物和2×SYBR Premix Ex Taq制成混合体系。采用实时定量PCR扩增仪进行检测,反应步骤:孵育95℃ 5min,然后94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s共40个循环。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

2 结 果

2.1CIH暴露后大鼠肝脏病理结构改变:在正常肝组织中,HE染色显示肝索呈放射状分布,围绕肝小叶中央静脉排列,未见炎性细胞浸润。与对照组相比模型组肝脏细胞结构紊乱,胞浆中出现不同大小和数量的脂肪空泡,细胞核萎缩(见图1)。

图1 各组大鼠肝脏组织病理变化(HE,n=6,×200,×400)

2.2CIH暴露后大鼠血清铁含量变化:与对照组相比,模型组血清铁含量及转铁蛋白饱和度显著下降,未饱和铁结合力显著上升。对照组和模型组大鼠血清中总铁结合力无显著差异(见表2)。

表2 各组大鼠血清铁血清总铁结合力血清未饱和铁结合力血清转铁蛋白饱和度水平

2.3CIH暴露后大鼠肝脏中铁含量及FTL蛋白水平:普鲁士蓝染色结果显示,与对照组相比模型组肝脏中铁含量显著增多(见图2)。Western blot结果显示,与对照组相比模型组大鼠肝脏FTL蛋白水平明显上升(见表3,图3)。

图2 各组大鼠肝脏普鲁士蓝染色(n=6,×200,×400)

图3 各组大鼠FTL蛋白表达水平

表3 各组大鼠FTL蛋白表达水平

2.4CIH暴露后大鼠肝脏中铁代谢情况:与对照组相比,模型组DMT1(+ire) mRNA和蛋白水平,TfR1 mRNA和蛋白水平均显著上升;DMT1(-ire) mRNA和蛋白表达无显著变化(见表4、5,图4)。与对照组相比,模型组肝脏FPN1 mRNA无明显变化,蛋白水平显著下降(见表5,图4)。

图4 各组大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1蛋白表达水平

表4 各组大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1 mRNA表达水平

表5 各组大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1蛋白表达水平

2.5CIH暴露后大鼠肝脏中hepcidin表达:与对照组相比,模型组肝脏hepcidin及IL-6 mRNA水平均显著上升(见表6)。与对照组相比,模型组大鼠肝脏STAT3蛋白发生明显磷酸化(见表7,图5)。

图5 各组大鼠p-STAT3/STAT 3蛋白表达水平

表6 各组大鼠hepcidin IL-6 mRNA表达水平

表7 各组大鼠p-STAT3/STAT 3蛋白表达水平

3 讨 论

有证据表明OSA患者体内铁蛋白水平明显升高,且与疾病严重程度成正比[8]。机体为适应低氧环境,需要大量铁元素以满足氧气运输,肝脏作为体内调控铁平衡的重要场所,也是受CIH影响的重要靶器官。当机体铁过载时,肝脏能迅速吸收非转铁蛋白结合铁(non-transferrin-bound iron,NTBI)并储存在肝细胞中[9]。本研究发现CIH暴露后大鼠血清铁含量和转铁蛋白饱和度下降而血清未饱和铁结合力显著上升,说明机体转运铁的能力下降;肝脏FTL蛋白表达上升,铁沉积显著增加;同时HE结果显示CIH暴露后大鼠肝脏出现病理损伤,这说明CIH可以引起肝脏铁沉积进而导致肝脏损伤。

肝脏中的铁代谢,包括铁的吸收、释放和存储都受到严格调控。机体铁的吸收主要依靠TfR1和DMT1,二者分别吸收Fe3+和Fe2+,进入到机体中的铁部分通过FPN1输出进入循环系统以满足生理活动需求,部分则储存在铁蛋白(Ferrtin)内[10]。本研究结果显示,CIH暴露后大鼠肝脏中TfR1和DMT1(+ire)的表达显著增加,而FPN1表达显著下降,这表明在CIH暴露期间,肝脏铁摄取增多、输出减少,导致铁沉积。

Hepcidin是调控系统铁代谢的中枢因子,高水平的hepcidin会抑制FPN1从巨噬细胞和肝脏中输出铁,导致血清铁的下降[11]。本研究发现肝脏中hepcidin mRNA水平显著升高,这说明hepcidin表达增加导致FPN1表达下降可能是CIH暴露引起肝脏铁超载的主要原因。Hepcidin作为一种抗菌肽,在受到炎症刺激时会被诱导表达。IL-6能够引起STAT3磷酸化,激活的STAT3可与HAMP启动子中的应答元件结合,促进hepcidin的转录,上调hepcidin的表达[12]。本研究结果显示,CIH暴露后大鼠肝脏中IL-6表达增加,p-STAT3/STAT3的比值也显著上升,这表明CIH 暴露可通过IL-6/STAT3通路造成肝脏中hepcidin的高水平表达。

综上所述,CIH暴露可以通过IL-6/STAT3通路导致肝脏hepcidin高表达,进而下调FPN1表达、增加TfR1和DMT1(+ire)介导的铁摄取,造成肝脏铁过载。这进一步阐明了CIH引起肝脏铁超载的具体机制,但仍需临床相关研究加以验证。