基于近红外光谱技术快速分析大米肽的主要成分

黄莹，赵彤，黄晶，孙鑫，陈曦，杨晓

中国健康促进基金会抗衰老营养与健康研发中心（武汉 430100）

近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）技术是一项实现样品定性或定量分析的绿色、快速直接分析方法[1]，其标准方法多达20余项[2]，被广泛应用到食品、制药等领域。研究报道，Caporaso等[3]利用NIRS技术实现谷物无损质量评估；Levasseur[4]和Femenias等[5]使用NIRS技术为谷物污染真菌后的检测提供了便捷方法。NIRS技术在大米中的应用非常普遍，如：鉴别掺假[6]、糊化[7]；区分不同地区[8-9]、年份的大米[10]；检测蛋白质[11]、重金属[12]、直链淀粉[13]、水分[14]、脂肪酸[15]等，实现大米各项指标的快速检测。

大米加工过程中会产生大量碎米和米糠，这些副产物通常仅简单处理后作为动物饲料利用，近年来这些副产物被加工提取得到大米肽，因为大米肽中的氨基酸和大米蛋白基本保持一致，但大米肽具有低抗原

性，低分子量，能被肠道快速吸收而被广泛应用。大米肽具有降血压[16-17]、调节免疫[18-19]、抗氧化[20]、抗高尿酸[21]、预防阿尔兹海默病[22]及预防牙周炎[23]等生物活性。虽然NIRS技术在大米中的应用较为广泛，但关于该技术在大米肽的应用鲜有报道，也缺乏相应的国家和行业标准，导致大米肽品质参差不齐，实验利用NIRS技术建立模型，通过近红外光谱技术快速检测大米肽蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪含量的方法，为大米肽相关品质指标的快速检测提供方法。

1 材料与方法

1.1 原料

105种大米肽（均为市售）。

1.2 材料与试剂

NaOH、CuSO4、K2SO4、H2SO4、HCl、硼酸、硫酸标准滴定溶液（国药集团化学试剂有限公司）；TCA、酒石酸钾钠、乙酸镁、无水乙醚、石油醚（沸程30~60 ℃，麦克林生化科技股份有限公司）；牛血清蛋白标准品（Albumin Bovine V cas 9048-46-8≥98%，HPLC）。

1.3 仪器与设备

SPX622ZH电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；TDZ5-WS离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；TU180紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；K1100全自动凯式定氮仪（海能未来技术集团股份有限公司）；JRX-10S曲线升温消化炉（济南精锐分析仪器有限公司）；S-433Dup全自动氨基酸分析仪[赛卡姆（北京）科学仪器有限公司]；HPX-9052MBE电热恒温干燥箱（上海博讯实业有限公司）；SupNIR-2700近红外光谱仪[聚光科技（杭州）股份有限公司]。

1.4 试验方法

1.4.1 测定蛋白质的方法

参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定（第一法 凯氏定氮法）》，试验重复3次取平均值。

1.4.2 测定多肽的方法

采用双缩脲法，参考汪志华等[24]和鲁伟等[25]的方法。

标准曲线：准确配制分别为0，2，4，6，8和10 mg/mL的牛血清蛋白质标准溶液，分别取1 mL，加入4 mL双缩脲试剂。混合均匀，在25 ℃下放置30 min，并在540 nm下测量颜色。第一支不含牛血清蛋白质溶液的比色管作为空白对照溶液。取2组测量值的平均值，以牛血清蛋白质的含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=0.047 1X+0.003 4，R2=0.999。

将市售大米肽分别准备3份，每份0.5 g左右，各用水溶解后定容至10 mL，每个样品取1 mL分别加入3 mL 15%的三氯乙酸水溶液，于涡漩混合仪混合均匀，静置10 min，在4 000 r/min下离心20 min，取1 mL上清液置另一支比色管中，加入4.0 mL双缩脲试剂，摇匀后在30 ℃下放置30 min，于540 nm测定吸光度（A），试验重复3次取平均值，肽含量（%）按式（1）计算。

式中：C为标曲查得的牛血清蛋白质质量浓度，mg/mL；V为取样体积，mL；n为样品稀释倍数；m为样品质量，g。

1.4.3 测定水分的方法

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（第一法 直接干燥法），试验重复3次取平均值。

1.4.4 测定灰分的方法

参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》（第一法 食品中总灰分的测定），试验重复3次取平均值。

1.4.5 测定脂肪的方法

参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（第一法 索氏抽提法），试验重复3次取平均值。

1.4.6 近红外光谱扫描参数

表1 近红外光谱建扫描参数

1.4.7 建模方法和异常样品剔除

根据105个大米肽样品的蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪含量和近红外的光谱数据，采用偏最小二乘（partial least squares，PLS）回归方法分别对这5个指标建立定量模型，并对模型进行优化，结合Savitzky-Golay-平滑、Savitzky-Golay-导数、多元散射校正、均值中心化等光谱预处理方法，得到大米肽主要成分的模型，并以模型评价参数SEC、RC、SECV、SEP、RP、RPDC、RPDV表征模型的预测效果[26-27]。

建模过程中，发现异常样品，一般要遵循重构光谱残差、预测浓度残差、杠杆值与学生化残差及光谱PLS分解主成分得分的聚类分析等标准进行异常样品的剔除[28]。

2 结果与讨论

2.1 大米肽样品扫描结果

大米肽样品经扫描后得到的近红外光谱如图1所示。大米肽样品的蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪含量结果见表2。

图1 大米肽样品近红外反射光谱

表2 大米肽样品的主要成分指标的含量

2.2 数据处理

对表2中105个大米肽样品的蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪进行统计分析，可知：105个大米肽样品的蛋白质含量范围为29.73%~103.00%，平均为64.84%±21.93%；多肽含量范围为25.88%~78.97%，平均为52.50%±16.95%；水分范围为3.71%~8.34%，平均为6.29%±1.00%；灰分范围为0.28%~5.63%，平均为2.07%±1.21%；脂肪的含量范围为0.01%~0.45%，平均为0.13%±0.08%。上述指标的数据范围可用于近红外光谱技术定量建模，将105个数据中84个样品作为定标集建立模型，21个样本作为验证集验证模型，数据统计如表3所示。

表3 大米肽样本主要成分数据统计

2.3 大米肽样品主要成分模型指标的建立

利用近红外光谱仪对大米肽样品进行建模方法的预处理，得到各主要成分模型的最佳条件，结果如表4所示。

表4 大米肽蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪模型的最佳条件

通过化学计量学软件得到各主要成分的马氏距离值与学生化残差值，从而排除异常样品。发现排除异常样品后的模型预测能力优于排除异常样品前。最终优化后各主要成分的模型参数如表5所示。

表5 大米肽样品蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪的内部验证结果

发现模型预测值和实测值的相关系数分别为0.983 26，0.985 73，0.968 86，0.978 60和0.976 51，说明各主要成分预测值和实测值的相关性较高。将各主要成分的实测值与光谱数据相对应，拟合出大米肽蛋白质模型、多肽模型、水分模型、灰分模型和脂肪模型，如图2所示。其中，大米肽蛋白质模型的线性方程为Y=0.983 26X+1.067 80，多肽模型的线性方程为Y=0.985 73X+0.760 69，水分模型的线性方程为Y=0.968 86X+0.195 71，灰分模型的线性方程为Y=0.978 60X+0.041 71，脂肪模型的线性方程为Y=0.976 51X+0.002 43。

图2 基于近红外光谱参数的大米肽蛋白质（a）、多肽（b）、水分（c）、灰分（d）和脂肪（e）的预测模型

2.4 大米肽样品主要成分模型指标的检验

分别对验证集中21个样品进行光谱扫描，采用2.3建立的模型预测蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪的含量，预测值和实际值对比结果如表6所示。通过t检验发现，蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪的实测值和预测值相比较均无显著性差异，主要表现为蛋白质（t=0.488，P=0.631＞0.05）、多肽（t=-0.180，P=0.986＞0.05）、水分（t=1.056，P=0.304＞0.05）、灰分（t=1.743，P=0.097＞0.05）和脂肪（t=1.606，P=0.124＞0.05），说明模型具有较好的预测能力。

表6 预测模型对大米肽样品蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪含量的预测结果

3 结论

大米肽样品蛋白质含量范围为29.73%~103.00%，平均为64.84%±21.93%；多肽含量范围为25.88%~78.97%，平均为52.50%±16.95%；水分范围为3.71%~8.34%，平均为6.29%±1.00%；灰分范围为0.28%~5.63%，平均为2.07%±1.21%；脂肪含量范围为0.01%~0.45%，平均为0.13%±0.08%；数据范围可用于近红外光谱技术定量建模。

根据PLS分别建立大米肽蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪的最优模型，结果发现模型预测值和实测值的相关系数分别为0.983 26，0.985 73，0.968 86，0.978 60和0.976 51，说明各主要成分预测值和实测值的相关性较高。对模型进行外部验证，蛋白质、多肽、水分、灰分和脂肪的实测值和预测值相比较均无显著性差异，主要表现为蛋白质（t=0.488，P=0.631＞0.05）、多肽（t=-0.180，P=0.986＞0.05）、水分（t=1.056，P=0.304＞0.05）、灰分（t=1.743，P=0.097＞0.05）和脂肪（t=1.606，P=0.124＞0.05），说明模型具有较好的预测能力。

关于NIRs技术在大米肽的应用报道相对较少，大部分集中在大米上面的应用，如：黄林森等[29]采用近红外定量模型快速检测大米的营养成分，实现营养成分的快速检测；路辉等[30]对大米直链淀粉、蛋白质、脂肪、水分建立近红外光谱检测模型，结果发现利用近红外光谱可以实现对大米中营养成分含量同时快速无损的检测；李路等[31]对大米蛋白质、脂肪、总糖、水分近红外检测模型研究，验证该模型适用于大米营养成分的近红外快速检测。试验说明NIRs技术在对大米营养成分的快速检测十分方便和快捷，验证NIRs技术对大米肽主要成分的快速检测同样适用，为大米肽主要成分的快速检测提供理论依据。