变废为宝——“下岗年桔”精油抗氧化和抑菌活性研究

张岩，曹薇，熊小宝，赵玉龙，邓镇涛

遵义医科大学珠海校区生物工程系（珠海 519041）

四季桔（Citrus mitisBlanco）是芸香科（Rutaceae）柑橘属（CitrusL.）常绿灌木或小乔木，是金桔（Fortunella margarita）和柑橘（Citrus reticulata）的杂交种，分布在热带和亚热带地区，我国南方栽培较为常见。树冠聚集，叶为深绿色，呈椭圆形。果实成熟时为橘黄色，直径约3~3.5 cm，果肉可食，口味较酸，可代绿檬使用。药用价值明显，有化痰、止咳、理气、消食等功效[1]，民间应用广泛。

四季桔作为一种观赏植物，在南方地区尤受欢迎。年前常被“请进家门”，俗称“年桔”。但节庆一过就要“下岗”，2020年仅深圳福田区年橘回收量高达30多万盆。若被乱丢乱扔，造成资源浪费和环境污染。针对这一现状，针对“废弃期”四季桔开展研究，提取不同部位（桔叶、青皮、黄皮）精油并分析其化学成分，对抗氧化和抑菌活性进行评价，为四季桔资源的综合利用提供试验基础。目前关于四季桔精油的研究主要集中在化学成分方面[2-4]，关于药理和生物活性方面的研究较少，所以课题具有一定的创新性。

植物精油是植物体内的次生代谢产物，主要由小分子化合物组成，芳香易挥发[5]。芸香科柑橘属植物精油（Citrus essential oils，CEOs）因抗菌活性好、安全性高（被美国FDA列为公认安全物质“GRAS”）、来源广、产量高、香味独特等特点，而备受关注；具有抑菌[5]、抗真菌[6]、抗氧化[7]、杀虫[8]、改善肝毒性和肾毒性[9]等多种生物活性；被广泛于医疗保健、食品防腐、果蔬保鲜、害虫防治、生态旅游和日化产品等领域。所以该课题具有良好的开发应用前景和现实意义。

1 试验

1.1 试验材料

植物：四季桔新鲜叶子、青果、黄果（采于2021年3月广东珠海西部，22°16’14.57”N 113°34’36.21”E）。

菌种：鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14 028、金黄葡萄球菌CVCC 1 885、李斯特菌ATCC 19 111、大肠杆菌CVCC 1 555（广东环凯微生物科技有限公司），按产品说明书进行复苏；青霉素G药敏片（杭州滨河微生物试剂有限公司）。

仪器：Agilent 7 890 B Agilent 5 977 A气质联用分析仪（安捷伦科技有限公司）；UV 2 600全自动紫外分光光度计（日本岛津）；FA 2 004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TC-15电热套（新华医疗器械厂）；JP-1 500 B高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；LDZX-75 KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SPX-150 B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SWCJ-2 F超净工作台（苏州净化设备有限公司）；TS-200 B全温震荡培养箱（上海市善志仪器设备有限公司）；101-2 A电热恒温干燥箱（广州市康恒仪器有限公司）。

试剂：C 7-C 30正构烷烃标准品、DPPH（1, 1-二苯基-2-苦基肼）、ABTS（2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐），美国Sigma公司；芳樟醇、桉叶油醇、榄香醇、柠檬烯、反式石竹烯、月桂烯、β-蒎烯、α-蒎烯（上海麦克林生化有限责任公司）；其他试剂（分析纯，上海麦克林生化有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 精油的提取

参照文献[6]方法并修改。将新鲜四季桔叶（800~900 g）、青皮（800~900 g）、黄皮（800~900 g），洗净、阴干、粉碎，过筛（0.250~0.850 mm）。采用克莱文格式装置，物料比为1∶5 g/mL，经水蒸气蒸馏1 h制得精油，经无水硫酸钠干燥，于4 ℃冰箱保存备用。精油得率按式（1）计算。

1.2.2 GC-MS分析条件

采用Agilent 7 890 B气相色谱系统，色谱柱为HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以正己烷为溶剂（10 mg/mL），载气为氦气，进样量为1 μL，流速为1.0 mL/min，分流比为20∶1。升温程序：50 ℃至150℃，3 ℃/min；150 ℃至250 ℃，15 ℃/min；升温至250 ℃后保持20 min。进样口和离子源的温度都是250℃。电离能量EI 70 eV，质量扫描范围为29~450。通过质谱库（NIST）、保留指数（RI）及参考文献数据鉴定化合物成分，通过面积归一化法各组分进行定量。

1.2.3 抗氧化活性评估

1.2.3.1 DPPH法

参照Sarrou等[10]方法并修改。取不同浓度的四季桔桔叶、青皮、黄皮精油溶液各50 μL，加入2.95 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（乙醇为溶剂），混合均匀，室温下暗处放置0.5 h，在517 nm测定吸光度。以BHT为阳性对照，每个样品做三组，每组测三次，取均值，DPPH自由基清除率按式（2）计算。

1.2.3.2 ABTS法

参照Tu等[11]方法并修改。将7.0 mmol/L ABTS 溶液和2.0 mmol/L K2S2O8等比例混合均匀，室温下暗处放置16 h，用二甲基亚砜将ABTS母液稀释至734 nm处吸光度为0.70±0.02。取1.8 mL ABTS+溶液，加入不同浓度的四季桔桔叶、青皮、黄皮精油溶液各0.2 mL，混合均匀，室温下暗处放置6 min，在734 nm测定吸光度。以BHT为阳性对照，每个样品做三组，每组测三次，取均值，ABTS自由基清除率按式（3）计算。

1.2.4 抑菌活性评估

1.2.4.1 抑菌圈的测定

采用滤纸片琼脂扩散法[12]，用无菌移夜枪吸取200 μL 106CFU/mL的悬菌液，在营养肉汤固体培养基平皿均匀涂布。取10 μL精油轻轻吸附在灭菌滤纸片（6 mm）上，将滤纸片轻放在含菌平皿后，于37 ℃培养24 h，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。以无菌蒸馏水为空白对照，以青霉素G药敏片为阳性对照，每个样品做三组，每组测三次，取平均值。精油对菌种的抑菌效果的判断标准[13]：抑菌圈直径大小＜6 mm，没有敏感抑菌作用；6~9 mm，低度敏感作用；10~14 mm，中度敏感抑制作用；15~20 mm，高度敏感抑制作用；＞20 mm，极度敏感抑制作用。

1.2.4.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用微量肉汤稀释法[14]，用比浊法配制108CFU/mL的悬菌液，用培养液调整为106CFU/mL。配制一系列梯度浓度的精油溶液（0.94，1.88，3.75，7.50，15.00，30.00，60.00，120.00，240.00和480.00 μL/mL）。向96孔板加入悬菌液和精油溶液各50 μL，混合均匀，细菌的最终浓度为5×105CFU/mL。以不接种菌液，不加精油溶液的液体培养基作为空白对照，以接种相同数量菌液，不加精油溶液的液体培养基作为培养对照，每个样品做三组。于96孔板37 ℃培养20 h后观察，记录MIC。

1.3 数据处理

数据处理用SPSS软件进行，差异不显著（P＞0.05）用同列数据肩标相同字母表示，差异显著（P＜0.05）则用不同字母表示。采用线性回归方法计算IC50值。

2 结果与讨论

2.1 精油得率

通过水蒸气蒸馏法从四季桔桔叶、青皮、黄皮中提取精油，精油状态及得率详见表1。LEO、IPEO、MPEO得率分别为0.28%，1.06%和0.80%，与文献报道基本相似。Cuevas-Glory等[4]发现四季桔桔叶、桔皮精油得率为0.29%和1.05%。Asikin等[15]对9—12月份台湾香檬研究表明，其果皮精油的得率为0.75%~1.75%，且果实成熟度越高，得率越低。MPEO的得率低于IPEO，与上述结论相符。精油的提取有水蒸气蒸馏法、压榨法、超临界萃取法等多种方法。其中水蒸气蒸馏法较为常见，具有设备简单、易操作、环境友好等优点，但提取时间较长，提取温度较高，易引起精油成分散失[16]。该法精油得率会受到植物品种、提取部位、成熟度、料液比、提取温度等多种因素的影响[17]。

表1 四季桔精油得率

2.2 四季桔精油GC-MS分析

四季桔桔叶、青皮、黄皮精油经GC-MS分析，通过质谱库（NIST）、保留指数（RI）及参考文献数据进行定性，通过面积归一化法进行定量，化学成分结果详见表2。从LEO、IPEO、MPEO依次鉴定出35，7和5种化合物，分别占各自总量的100.00%，99.89%和99.88%。

表2 四季桔精油GC-MS分析

四季桔不同部位精油的化学成分差异较大。桔叶精油（LEO）的主要化学成分是含氧倍半萜（32.74%）和含氧单萜类化合物（32.30%），含量较多的化合物是芳樟醇（27.24%）、榄香醇（12.57%）和大根香叶烯（8.69%）。桔皮精油（IPEO、MPEO）中的主要成分是单萜类化合物（＞95.00%），其中柠檬烯含量最高（＞85.00%）。IPEO含有少量含氧单萜（1.24%），而在MPEO中并未检测到（表2）。

植物精油的化学成分受到多种因素的影响，其中植株的品种是确定含量和成分的主要原因[5]。四季桔果皮精油的主要成分是柠檬烯，与柑橘属果皮精油成分一致[2-4,7]。提取部位也是重要的影响因素，四季桔桔叶精油和果皮精油化学成分差异较大（详见表2）。Cuevas-Glory等[4]发现四季桔桔叶主要成分是单萜（41.8%）和含氧倍半萜（13.5%），桔皮精油的主要成分是柠檬烯（77.0%）。即使是同一部位，果实的成熟度对化学成分也有影响。MPEO的柠檬烯含量略高于IPEO，与文献中果实越成熟，精油柠檬烯的含量越高的结论一致[15]。此外，植物精油的化学成分还受到提取方法、气候条件、地理位置及土壤组成等因素影响[5,18]。

2.3 四季桔精油抗氧化活性

抗氧化试验中，四季桔桔叶、青皮、黄皮精油对两种自由基均呈现出一定的清除能力，对DPPH的清除能力优于ABTS。如表3和图1所示，MPEO、IPEO、LEO和BHT对两种自由基的抗氧化能力依次增强，且呈浓度依赖关系。在DPPH中，IC50值分别为4.563±0.275，3.013±0.060，2.699±0.424和0.229±0.022 mg/mL；ABTS中，LEO和BHT的IC50值分别为5.149±0.132和0.206±0.021 mg/mL，MPEO、IPEO抗氧化能力较弱。

图1 四季桔精油对DPPH和ABTS的清除能力

表3 四季桔精油IC50值

研究表明柑橘属植物精油具有抗氧化活性[10,13,19]。Choi等[19]发现34种柑橘属植物精油对DPPH自由基的清除率为17.7%~64.0%。同浓度下，LEO、IPEO、MPEO的清除率分别为70.6%，61.4%和44.9%，与文献基本一致。

四季桔不同部位精油的抗氧化活性差异较大，可能与其化学成分有关[13,25]。研究表明化合物邻-伞花烃、4-萜烯醇、松油醇、石竹烯、β-蒎烯、β-月桂烯、芳樟醇具有较好抗氧化活性。LEO活性最强，可能与其含有邻-伞花烃、4-萜烯醇、松油醇、芳樟醇、石竹烯等化学成分有关[13,25]。

桔皮精油中，MPEO抗氧化活性弱于IPEO，与文献中果皮成熟度越高精油清除DPPH自由基的能力越弱[15]结论一致。柠檬烯在MPEO中含量高达92.03%，说明它不是果皮精油抗氧化活性的关键成分。如图1所示，当质量浓度小于2.4 mg/mL时，IPEO和MPEO清除DPPH自由基能力基本一致（P＞0.05），当质量浓度大于2.4 mg/mL时，两者差异明显（P＜0.05）。可能是IPEO中含量较少的成分在起主要作用，它们的浓度随着精油浓度的提高而增加，当达到一定值后，它们使IPEO的抗氧化能力明显增强，与MPEO出现显著差异（P＜0.05），推测IPEO的各组分之间可能会有协同作用，对精油的抗氧化活性起主要作用。

2.4 四季桔精油抑菌活性

抑菌试验中，四季桔精油对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、李斯特菌）和革兰氏阴性菌（沙门氏菌、大肠杆菌）都有抑菌的效果，具有广谱抗菌性。由表4可知：LEO对四种菌都为极敏（26.76~32.20 mm），IPEO对大肠杆菌为极敏（22.76 mm），其余为中敏（12.60~13.70 mm）；MPEO对李斯特菌为中敏（10.03 mm），其余为低敏（7.53~9.13 mm），而阳性对照青霉素药敏片抑菌直径为14.43~20.93 mm。由表5可知：LEO对金黄色葡萄杆菌、沙门杆菌、大肠杆菌、李斯特的MIC分别为1.88，1.88，1.88和30 L/mL；MPEO为2 240，40，60，240 L/mL；MPEO在0.94~240 L/m时，对四种菌均无抑菌效果。以上结果显示，三种精油中，LEO的抑菌活性最强，IPEO次之，MPEO最弱。

表4 四季桔精油及相关化学成分抑菌圈大小（±S） 单位：mm

表4 四季桔精油及相关化学成分抑菌圈大小（±S） 单位：mm

样品金色葡萄球菌大肠杆菌沙门氏菌李斯特菌LEO32.20±0.20a26.76±0.35a27.13±0.15a28.53±0.25a IPEO13.17±0.15c22.76±0.15b12.60±0.20d13.70±0.26e MPEO9.13±0.25e7.53±0.32g7.30±0.20hi10.03±0.94g芳樟醇9.74±0.32d11.88±0.62d11.27±0.33e16.10±0.83c桉叶油醇7.32±0.17f9.95±0.57e7.78±0.44gh21.24±1.79b榄香醇7.42±0.19f11.33±0.42d11.23±0.41e16.04±0.92c柠檬烯7.38±0.01f13.17±0.24c8.34±0.13fg11.85±0.35f反式石竹稀6.81±0.32g6.00±0.00h6.75±0.23i11.27±0.06f月桂稀7.04±0.27fg6.00±0.00h8.57±0.71f6.00±0.00h β-蒎稀6.56±0.01g8.88±0.12f8.17±0.56fg11.71±0.54f α-蒎稀9.97±0.14d22.46±0.30b13.68±0.70c14.79±0.16d青霉素药敏片15.26±0.11b11..43±0.20d16.33±0.15b20.93±0.30b蒸馏水6.00±0.00h6.00±0.00h6.00±0.00j6.00±0.00h注: 敏感性的标准: ≤6 mm不敏, 6~9 mm低敏, 10~14 mm中敏,15~20 mm高敏, ＞20 mm极敏。数据处理用SPSS软件进行, 差异不显著 (P＞0.05) 用同列数据肩标相同字母表示, 差异显著 (P＜0.05)则用不同字母表示。

表5 四季桔精油最低抑菌浓度

研究表明植物精油抑菌活性与其化学成分相关[13,20-22]。此试验对四季桔精油的主要化学成分进行了抑菌活性评价，详见表4。芳樟醇、榄香醇、桉叶油醇、柠檬烯、桧烯、月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯均显示出一定的抑菌活性，与文献报道基本一致[13,20-22]。其中含氧化合物（芳樟醇、榄香醇、桉叶油醇）对李斯特菌的抑菌活性明显强于萜类化合物（柠檬烯、桧烯等）。LEO的抑菌活性显著强于其主要成分芳樟醇、榄香醇、桉叶油醇的抑菌活性（P＜0.05）；IPEO的抑菌活性强于主要成分柠檬烯的抑菌活性（P＜0.05），推测四季桔精油中各组分可能有协同作用，虽然有的化学成分含量少，但对精油的生物活性起重要作用。

Sadgrove等[22]对芸香科21种植物精油研究发现含有倍半萜醇如榄香醇、桉叶油醇异构体的精油抑菌活性较强，而主成分是单萜类的精油抑菌活性较弱。此试验呈现出同样的规律，LEO主要成分是含氧单萜和含氧倍半萜，活性最强；IPEO和MPEO主要成分是是单萜（柠檬烯＞85%），活性次之。IPEO和MPEO同为果皮精油，但抑菌活性差异显著（P＜0.05），推测可能是IPEO中含量极少的含氧单萜类化合物（1.24%）在起重要作用。

3 结论

文章对四季桔黄皮、青皮、桔叶精油的化学成分和生物活性开展研究。研究发现：四季桔精油对DPPH、ABTS自由基均显示出明显的清除能力，且有量效关系；对革兰氏阳性和阴性菌都有抑菌的效果，具有广谱抗菌性。试验表明精油的生物活性与化学成分密切相关。LEO的主要化学成分是含氧倍半萜（32.74%）和含氧单萜类化合物（32.30%），抗氧化和抑菌活性最好。在DPPH中的IC50值为2.699±0.424 mg/mL，对金黄葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌都为极敏（26.76~32.20 mm）。而MPEO和IPEO同是桔皮精油，化学成分相似（柠檬烯＞85%），但抗氧化和抑菌活性差异显著（P＜0.05）。在DPPH中的IC50值分别为3.013±0.060和4.563±0.275 mg/mL。IPEO对四种菌的敏感级别为中敏或极敏（12.60~22.76 mm）；MPEO则为低敏或者中敏（7.53~10.03 mm）。推测可能是IPEO中含量极少的含氧单萜类化合物（1.24%），对精油的抗氧化及抑菌活性起了关键性的作用。

四季桔精油作为一种天然混合物，由多种小分子化合物组成。精油的生物活性是各种化合物相互作用的整体表现。四季桔桔叶和青皮精油的抑菌活性强于主要活性单体化合物（如LEO＞芳樟醇、榄香醇、桉叶油醇；IPEO＞柠檬烯）。推测四季桔精油各组分之间可能存在协同作用。研究表明，不同的化合物的抑菌作用机制不同。如萜类化合物通过损坏微生物细胞壁质结构，从而使细胞膜结构破坏，细胞质外泄，最终导致细胞裂解而亡[23]。而含氧类化合物如芳樟醇可使细胞膜产生凹陷皱破，损坏细胞壁和细胞膜的完整性和通透性，影响能量代谢，导致微生物死亡[24]。各化合物之间的相互作用既可以提升精油的抑菌活性，又可以避免使用单体化合物对菌种产生的耐药性。所以四季桔精油作为天然抑菌剂，具有独特优势和良好的开发利用价值。关于四季桔精油成分之间的协同抑菌机理有待进一步研究。

综上，针对节庆过后，观赏类植物四季桔被乱丢乱扔，污染环境，浪费资源的现状，对废弃植物开展研究，探究其开发利用价值，具有现实意义。试验表明四季桔精油具有较好的抗氧化和抑菌活性，可作为天然食品防腐剂开发利用。此外，柑橘属精油已经被广泛应用在医药、美容、农业等各个领域，四季桔精油的其他方面的应用价值有待进一步研究。