土壤中有效硼含量测定方法优化与对比

占国艳 潘 政 梁红芳 潘晓威 梁耀辉 曾绍东 叶剑芝*

(1.中国热带农业科学院 农产品加工研究所/农业农村部农产品加工质量安全风险评估实验室(湛江),广东 湛江 524001;2.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所/中心实验室(句容),江苏 句容 212400)

土壤中微量元素是农作物需求很少但必不可少的元素,对作物生长调节及产量调控起到重要的作用[1]。例如硼是农作物必需微量元素,对作物生殖器官的形成和发育起重要作用,硼还能增加作物的抗逆性,增强作物的抗旱、抗病能力等。硼素供应不足,会导致植株生长不良,产品的质量和产量下降[2-3]。作物吸收的硼主要来自土壤,土壤的含硼量对其至关重要。一般作物直接从土壤中吸收的是有效态的硼,土壤中有效硼含量在0.5～1.0 mg/kg时对作物生长是最有利的,过高或过低都会对农作物产生不良影响[4-5]。准确测定土壤中有效硼含量有助于合理评价及调控土壤中有效硼含量,对指导农业生产具有重要意义。另外有效硼是全国测土配方施肥项目必测元素之一,也是《耕地质量调查监测与评价办法》中长期监测的指标,同时第三次全国土壤普查也将其纳入监测指标体系中,因此准确高效测定土壤中的有效硼尤为重要。

土壤中有效硼含量的测定常采用分光光度法,包括姜黄素分光光度法[6]和甲亚胺-H分光光度法[7],两种方式均是将土壤样品直接煮沸后加入姜黄素或甲亚胺-H进行分光光度法测定。姜黄素分光光度法操作复杂,对样品反应过程控制要求严格,实际测试采用较少[8]。甲亚胺-H分光光度法操作简单快速,适合多个样品测定,也适合有效硼含量较高样品的测定,方法应用比较普遍。但其灵敏度较低,显色温度及光照等因素容易对测试结果造成干扰[9]。另外有效硼的测定前处理方式是采用直接煮沸的方式进行处理,煮沸时间以及煮沸强度等不易控制,常会造成结果出现较大偏差[10],且直接煮沸所需的石英玻璃耗材昂贵,成本过高。已有研究对有效硼测定前处理过程进行优化,比如采用沸水浴浸提法[11]、微波提取法[12]等。其中沸水浴浸提法成本低、容易控制、效率高等,已被普遍认为适用于有效硼测试前处理过程[13]。目前关于沸水浴浸提法的浸提时间、浸提方式等研究较多,但结论较多,尚不统一;而且目前关于分光光度法测定有效硼含量的方法研究对显色过程的影响分析不足。

鉴于此,在前人的研究基础上,对沸水浴浸提分光光度法测试土壤有效硼的过程进行全流程的分析,重点考察浸提时间和浸提方式的影响,同时对显色过程中温度及光照等因素影响进行分析,以进一步优化沸水浴浸提甲亚胺-H分光光度法测试有效硼的条件,获得更准确有效的结果。同时考虑到随着检测技术和设备的不断发展,越来越多的实验室有条件采用电感耦合等离子体发射光谱法测试土壤有效硼含量[13-14],本文对ICP-OES法测定土壤有效硼进行验证对比,结合在第三次全国土壤普查内业检测试点工作中的经验概括归纳两种方法的优点、不足及适用范围,以期为“三普”内业检测提供技术参考和借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

AUY 120电子天平(岛津仪器)、DTT-A1000恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、HH-4恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、722N可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)以及电感耦合等离子体发射光谱仪(Thermo Fisher Scientific、ICAP7200)等。

硫酸镁(MgSO4·7H2O)、硫酸(1/2H2SO4)、高锰酸钾(1/5KMnO4)、甲亚胺、抗坏血酸、乙酸铵及EDTA二钠盐等,均为分析纯。实验所用水为现制备的一级水,硼标准储备溶液(100 μg/mL)购于中国计量科学研究院。

土壤有效态成分标准土壤样品均为中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所研制,定值日期为2022年4月,有效期为5年,现均在有效期内。

1.2 实验方法

1.2.1 有效硼浸提剂的配制

硫酸镁浸提剂:准确称取1.0 g硫酸镁溶解于水中,并稀释至1 L,即得到浓度为1 g/L的硫酸镁溶液。

1.2.2 土壤有效硼的提取

称取10.00 g土壤样品于50 mL塑料瓶中,加1 g/L的硫酸镁溶液20 mL,塞好瓶盖,摇匀,在100 ℃的恒温水浴锅中加热浸提12 min,取出后稍冷后一次性过滤于塑料烧杯中,滤液作为待测溶液。

1.2.3 试样的测定

分光光度法:吸取过滤后的滤液4 mL于10 mL塑料分光光度管中,加入0.5 mL酸性高锰酸钾溶液,摇匀,放置2～3 min,加入0.5 mL抗坏血酸溶液(100 g/L),摇匀,待紫红色消褪且褪色的二氧化锰沉淀完全溶解后,加5.00 mL混合显色剂,摇匀,于23 ℃的恒温培养箱避光放置1 h,取出后于波长415 nm处,用2 cm光径比色皿进行分光光度测定。以扣除空白后的吸光值查校准曲线得到待测液的硼含量。

ICP-OES法:过滤后的试液直接上机测试,从仪器的校准曲线中直接读取有效硼浓度值。仪器测试参数为:射频功率为1 150 kW,载气为高纯氩气(纯度≥99.99%),辅助气流量为0.5 L/min,雾化器气体流量为开,泵速45 r/min,元素分析谱线为208.89 nm。

1.2.4 标准溶液及标准曲线的绘制

分光光度法:吸取2.50 mL硼标准溶液于25 mL容量瓶中,用水定容,得到10 mg/L硼标准储备溶液,储于塑料瓶中。然后吸取10 mg/L硼标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于7个50 mL容量瓶中,用水定容,得到0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L硼标准系列溶液,将上述标准系列溶液保存在塑料瓶中。分别吸取0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L硼标准系列溶液4.00 mL于10 mL塑料比色管中,硼的含量分别为 0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 μg,同试样测定方法操作步骤测定。用标准系列溶液的零浓度调节仪器零点,计算回归方程及绘制工作曲线。

ICP-OES法:将0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L硼标准系列溶液依次上机测试,在208.89 nm波长下以硼的质量浓度为横坐标,以发射强度值为纵坐标,建立校准曲线。

1.3 数据处理

所有统计分析均使用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0进行,图形使用Origin 2018软件绘制。

2 结果与讨论

2.1 水浴浸提时间的选择

采用沸水浴浸提方法提取土壤样品中有效硼含量时,浸提时间是影响有效硼含量测定准确度的关键因素之一。若浸提时间过短,土壤中硼在浸提剂中溶解未达到平衡,提取不充分,所测的有效硼含量会偏低。浸提时间太长,则会耗费过多时间,降低测试效率。前人对浸提时间已有过研究,但结论在4～50 min,差异较大[12,15]。为优化浸提过程,确定最佳浸提时间,本文拟对沸水浴浸提方式不同时间内所提取的有效硼含量变化进行分析。

选取4个不同含量的标准土壤样品[ASA-5b(0.26 mg/kg±0.05 mg/kg)、ASA-6b(0.13 mg/kg±0.04 mg/kg)、ASA-7a (0.68 mg/kg±0.08 mg/kg)、ASA-9a(0.43 mg/kg±0.05 mg/kg)]进行实验,按照提取步骤进行操作,将装有浸提剂和土壤样品的瓶子放置在沸腾的水浴锅中,并开始精确计时4、8、12、20、30、50 min,取出后显色测定有效硼含量,所测得的有效硼含量随浸提时间变化情况如图1所示。

图1 有效硼测试结果随浸提时间变化情况Figure 1 Change of available boron test results with the leaching time.

由图1中可以看出,不同浸提时间所获得的有效硼含量存在较大差异。具体来看,前期浸提时间在12 min内,浸提时间越长,所测得的土壤有效硼含量越高,后面继续延长浸提时间,有效硼含量变化不大。通过将所测的有效硼含量值与标准值比较,并计算相对误差,以判断测定结果的准确度。图1显示在浸提12 min后,所得的有效硼含量已接近标准值,相对误差也较低(8%),准确度较好,之后继续浸提,有效硼含量变化不大。当浸提时间达到50 min后,有效硼含量相比12 min时有所增加,偏离标准值,且相对误差较大(15%)。

保证土壤样品中的有效硼能被浸提剂充分提取是获得准确有效硼含量的关键。研究发现,采用沸水浴浸提方式12 min即能将土壤中的有效硼充分提取出来,之后继续浸提,有效硼含量会有增加,这可能是浸提时间过长,除了有效硼被提取,还有部分其他形态的硼被提取出来,使得测定结果偏高[11]。因此,沸水浴浸提时间选择12 min。

2.2 水浴浸提方式的选择

在得出了沸水浴浸提土壤有效硼适宜浸提时间后,尝试探究沸水浴浸提方式下是否加盖浸提对提取土壤有效硼的影响。选取4个不同含量的标准土壤样品,按照提取条件进行提取,并设计加盖密闭浸提和不加盖敞开浸提两种方式进行比较。两种方式下对土壤样品浸提12 min后,测定土壤样品中有效硼含量。不同浸提方式下所测定的有效硼含量差异如图2所示。

图2 不同浸提方式下测定的有效硼含量差异Figure 2 Difference of available boron content determined by different leaching methods.

从图2中可以看出,两种浸提方式下所测定的有效硼含量差异不明显。同一土壤样品重复平行性标准偏差为0～4%,所测定的结果稳定性较好。不同土壤所测的结果均在标准值范围内,相对误差0～8%。说明两种浸提方式测定的结果都能有较好的稳定性和准确性,是否加盖浸提对提取土壤有效硼没有明显的影响。鉴于开盖方式会存在浸提液倾洒的风险,导致测试出现误差,所以实际测试过程中推荐采用加盖浸提方式为佳。

2.3 显色条件的优化

由上述的研究可知,对分光光度法测试土壤有效硼的前处理过程进行优化可以提高测定有效硼含量的准确性。除此之外,分光光度法测试中显色过程对测试结果也会产生一定的影响,往往显色时间和温度等条件的不同,测试结果会出现较大的差异。对于土壤有效硼的测试,NY/T 1121.8—2006[7]对于显色过程没有特别说明,然而在实际操作过程中发现,按照NY/T 1121.8—2006操作后,显色结果并不理想,分析原因后推测可能是没有对显色过程中的光照和温度条件进行控制。为了验证推论并对显色过程进行优化,本研究采用避光恒温的方式显色,以便更好地控制显色过程,并和常规显色方式进行比较,分析光照和温度对显色过程的影响以及避光恒温方式显色的效果。

选取4个不同含量标准土壤样品按照确定的提取方式进行浸提,即加硫酸镁溶液20 mL,沸水浸提12 min后取出过滤,按照实验方法绘制标准曲线和测试滤液中有效硼含量。同时按照NY/T 1121.15—2006方法将显色液配制好放置1 h后进行显色测试。按照两种方式显色所绘制的标准曲线和所测的土壤样品有效硼含量分别如图3和图4所示。

图3 不同显色方式下绘制的标准曲线Figure 3 Standard curves drawn under different color rendering methods.

图4 不同显色方式下测定的有效硼含量差异Figure 4 Difference of available boron content determined by different color rendering methods.

从图3、4的结果能够看出,两种方式处理显色后所绘制的标准曲线差异很大,并且所测得的土壤有效硼含量相差较大。图3显示按照标准推荐的常规显色方式所绘制的曲线线性较差,相关系数r只有0.996 9,表明这种方式不能有效地控制显色过程的光照和温度等因素影响,使显色过程出现较大偏差,直接导致后续样品测试结果不准确。相比之下,采用避光恒温的方式结果较好,显色后所绘制的曲线相关系数r为0.999 7,显著优于恒温显色的方式(p<0.05),表明这种方式能够很好地改善显色过程中光照和温度等因素影响,后续样品测试结果也更准确。图4中两种显色方式下所测得的土壤有效硼含量也有显著不同(p<0.05),主要表现为常规显色方式所测得的有效硼含量普遍偏低,甚至低于标准值的不确定度范围,相对误差较高(13%～31%)。相比之下,避光恒温方式所测得的有效硼含量准确度较好,相对误差较低(0～8%)。另外从图4中可以看出,采用避光恒温方式显色所测得的重复土壤样品平行性也更好,标准偏差为1%～2%,说明采用避光恒温方式显色可以获得较为稳定的结果。

对分光光度法测试土壤有效硼方法显色过程进行优化,可以有效地提高测试结果的稳定性和准确性。结果表明,光照和温度会对有效硼测试显色过程产生较大的影响,光照的影响和温度不稳定会导致显色过程出现较大偏差,从而使得测定的结果明显偏低。显色剂中的甲亚胺-H酸不稳定,遇光容易分解,致使显色过程不稳定,影响结果的测定[13]。另外,由于甲亚胺-H试剂颜色较深,对吸光度的影响较大,温度的变化容易影响硼与甲亚胺-H酸络合物稳定性,进而容易引起吸光度的变化,对测定结果造成较大误差[15]。因此,在实际测试时有必要在显色过程中避免光照的影响以及保持显色过程温度的稳定。

2.4 测试有效硼的方法对比

在探讨了分光光度法测试土壤有效硼的一些优化措施后,拟对优化后分光光度法测试土壤有效硼的准确性进行验证,并对ICP-OES法测定土壤有效硼进行探讨,从检出限及定量限、线性范围、精密度、准确度等参数对分光光度法和ICP-OES法测试土壤有效硼进行对比分析。

2.4.1 校准曲线和检出限

分光光度法按照测定步骤对工作曲线进行测定,以吸光度为纵坐标,以溶液中硼含量为横坐标,绘制标准曲线,并进行线性回归。结果表明,当硼含量范围为0～4.00 μg时,工作曲线线性方程较好,相关系数r为0.997,符合分析测试的要求。ICP-OES法参照仪器工作条件在208.89 nm波长下对硼工作曲线进行测定,选取配制好的标准系列溶液,以硼的质量浓度为横坐标,以发射强度值为纵坐标,建立校准曲线。结果表明当硼的质量浓度范围为0～1 000 μg/L时,工作曲线线性方程较好,相关系数r为0.999 9,符合分析测试的要求。对两种测试方法测定并拟合得出的校准曲线如图5所示。

图5 分光光度法及ICP-OES法测试有效硼的工作曲线Figure 5 Working curve of available boron tested by spectrophotometric method and ICP-OES method.

检出限按照《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)中的具体要求执行。分别对空白样品进行8次独立测试,方法检出限参照HJ 168—2020的附录A进行计算,并以4倍检出限作为测定下限。分光光度法、ICP-OES法测定有效硼的检出限、测定下限见表1。分光光度法检出限为0.012 mg/kg,测定下限为0.048 mg/kg;ICP-OES法检出限低于分光光度法,为0.009 mg/kg,测定下限为0.036 mg/kg。

表1 检出限、测定下限结果对比Table 1 Comparison of detection limit and lower limit of detection results(n=8) /(mg·kg-1)

2.4.2 方法精密度和准确度

分别选取高、中、低三个不同含量的有值标准土壤样品(ASA-2b-CZ、ASA-6b-CZ、ASA-7a-CZ)按实验方法每个样品平行测定6次,并采用ICP-OES同样测定6次。分别计算不同含量样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差等各项指标,同时和标准值进行对比,计算其相对误差,两种方式测定的不同土壤样品有效硼含量精密度和准确度测试结果见表2。结果显示,不同标准土壤样品的测定结果均在标准值范围内,相对标准偏差<10%,相对误差<10%,精密度和准确度均满足《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》(GB/T 27417—2017)的要求。

表2 精密度及准确度测试结果对比Table 2 Comparison of precision and accuracy test results /(mg·kg-1)

2.5 实际样品比对测试

为进一步验证显色法和ICP-OES法测试的适用性,选取我国江西、四川以及安徽等地的农用地土壤为代表,采用两种方法进行土壤有效硼测试比对。每种土壤平行测定三次,计算平均值及标准偏差,测定结果如表3所示。结果表明分光光度法测试标准偏差为1%～3%,ICP-OES法测试标准偏差为0.5%～0.8%。两种方法均可用于土壤有效硼的测定,并且二者的测定结果无显著性差异,但ICP-OES法测试结果标准偏差更低,稳定性较好。

表3 实际样品有效硼测试结果Table 3 Available boron test results of actual samples /(mg·kg-1)

分光光度法的检出限(0.012 mg/kg)略高于ICP-OES法(0.009 mg/kg),采用不同方法测试有效硼时将导致结果存在一定的误判率,即当样品的含量介于0.009～0.012 mg/kg时,分光光度法的测定结果为未检出,ICP-OES法的测定结果为检出。因此,在分析测试实际土壤样品中有效硼含量时应根据实际需求合理选择检测方法。鉴于第三次全国土壤普查工作的科学性、严谨性,建议选取ICP-OES法测定土壤中有效硼。另外,ICP-OES法的精密度和准确度都优于分光光度法,实际样品测试也显示ICP-OES法获得的结果更为稳定。我国土壤中的有效硼含量尤其是东南地区土壤中的有效硼含量普遍较低(<0.5 mg/kg)[16],分光光度法测试过程相对繁琐,对于低含量的土壤测试也更容易产生误差。ICP-OES法因为不需要加各种显色剂显色处理,所以检测简便,所得的结果也更准确和稳定,对于低含量有效硼的测试更为有效。

3 结论

对沸水浴浸提分光光度法的测试条件进行了分析并提出了优化措施,以及从检出限及定量限、线性范围、精密度、准确度等条件对分光光度法、ICP-OES法进行了对比,比较两种方法的优点和不足以及适用范围,结果表明:

1)沸水浴浸提分光光度法测试土壤有效硼时提取时间选择12 min、加盖浸提以及23 ℃避光显色处理,可以获得更为准确的结果。

2)分光光度法检出限为0.012 mg/kg,ICP-OES法检出限为0.009 mg/kg,两种方法的准确度和精密度均符合要求,均可用于土壤有效硼的测定并且二者的测定结果无显著性差异。

3)对于硼含量(>0.5 mg/kg)高的样品,分光光度法、ICP-OES法均适用,中、低含量(<0.5 mg/kg)样品建议采用ICP-OES法测定。