酿酒酵母启动子的克隆及特性表征

孙琳琳,刘啸尘,张宇飞,武占省,岳骏松

(西安工程大学 环境与化学工程学院/西安市纺织化工助剂重点实验室,陕西 西安 710048)

0 引 言

合成生物学作为“未来改变世界的十大新兴技术”,在生物医药、材料、环境、能源等领域发挥越来越重要的作用[1-2]。合成生物学解决这些领域重大问题的思路是通过改造或重新构建底盘细胞的代谢途径赋予底盘细胞新功能,形成可持续的生物制造工艺[3-4]。如使用可再生原料开发化学品、燃料和营养保健品等高附加值物质[4-5]。然而,新引入的代谢途径会影响底盘细胞的内源性代谢途径的代谢流,这与确保细胞存活的需求相冲突。因此,如何平衡底盘细胞生长与新代谢途径的代谢流是底盘细胞高效发挥功能的核心问题之一。酿酒酵母是食品工业中一类重要微生物[6],因其具有生长速度快、遗传背景清晰、易于培养和安全性高的特性,被作为最常用的真核底盘细胞应用于合成生物学领域[7]。酿酒酵母被广泛应用于生产高附加值生物化学物质中,如人参皂苷[8]、青蒿素[9]、白藜芦醇[10-11]以及木糖[12]等。而启动子作为合成生物学和代谢工程中控制和调控基因表达中至关重要的工具[13],不仅影响着外源基因的表达,还与本源基因的调控密切相关,研究启动子对于基因的恰当表达以及遗传构建体的快速表型化具有重要意义[14]。

高强度的启动子并不意味着能够产生更多的产物[15],这是由于这些基因的异常高转录会给宿主造成过多的代谢负荷,从而影响产物产量和品质[14,16]。更换不同启动子[17]以及优化启动子元件[18]为调节细胞内代谢途径中关键基因表达水平提供了解决思路。李荣生等应用基因编辑技术将PERG20的启动子替换为环氧鲨烯环合酶启动子PERG1,研究启动子对于单萜化合物生产的影响,调控表达强度后,以看成牛尨牛儿基焦磷酸(GPP)为前体的芳樟醇产量提高42.5%,以橙花基焦磷酸(NPP)为前体的橙花醇产量提高1 436.4%[19]。孙玲等通过更换启动子构建酿酒酵母工程菌,以期获得高产番茄红素的目的菌株,调控表达强度后的番茄红素产量提高8.09倍[20]。为了寻找效果最佳的启动子,许多研究根据内源性启动子在不同生长条件下的表达强度对其进行了表征或构建了启动子库,启动子库的构建对酿酒酵母基础研究提供更多的参考和实用工具[21-23]。在检测启动子表达强度时,报告基因是最常用的辅助工具。LIANG等使用酵母增强的绿色荧光蛋白(yEGFP)作为报告基因,对酿酒酵母在压力条件下和木糖存在下各种启动子的活性进行了表征[24]。

因此本文基于这种思路,以酿酒酵母细胞INVSc1为宿主菌株,筛选得到6段启动子序列,以pRS41H为出发质粒,利用绿色荧光蛋白基因表达,成功构建6个重组质粒。通过流式细胞仪对6株工程菌株的荧光表达强度测定,分析启动子的表达EGFP强度,并探究启动子随着酿酒酵母生长过程中的活性以及强度变化,丰富和构建酿酒酵母启动子文库,为获得高质量合成生物学启动子元件提供参考价值。

1 实 验

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1菌株作为启动子克隆的模板。E.coli DH5α用于重组质粒的验证和鉴定。质粒pRS41H为酿酒酵母表达载体,大小为5 388 bp。上述菌株和质粒保存于本实验室。

1.1.2 实验药品

胰蛋白胨与酵母提取物(英国OXOID公司,试剂级别为GR);葡萄糖和氯化钠(西陇化工有限公司,试剂级别为AR);甘油、无水乙醇、冰醋酸和Na2HPO4(北京化学试剂公司,试剂级别为AR);Tris饱和酚、D-山梨醇和EDTA(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);DNA Marker(根据实验要求选自北京博迈德公司,货号为BM 2000,由6条DNA条带组成,分别为100 bp(50 ng/5 μL)、250 bp(50 ng/5 μL)、500 bp(50 ng/5 μL)、750 bp(75 ng/5 μL)、1 000 bp(50 ng/5 μL)和2 000 bp(100 ng/5 μL));实验中用到的凝胶电泳DNA分子量对照均为BM 2000。Taq DNA聚合酶(生工生物工程(上海)有限公司);dNTP Mixture和rTaq DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司);限制性内切酶BamHI、EcoRI、Sal I(美国Fermentas公司);DNA提取试剂盒(上海碧云天生物技术)。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与启动子的克隆

过夜培养酿酒酵母,使用DNA提取试剂盒提取酿酒酵母基因组 DNA,于-20 ℃保存备用。从NCBI数据库查询酿酒酵母全基因组,分析数据并筛选启动子。使用SnapGene软件根据启动子碱基序列设计引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,用于启动子的克隆。启动子筛选及引物设计如表1所示。

表 1 引物设计

表1中下划线对应限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sal I的酶切位点。以酿酒酵母基因组为模板进行PCR实验以得到目的基因片段。将得到的启动子片段通过凝胶回收的方法纯化,用于后续载体的构建。

1.2.2 pRS41H-Promoter-EGFP载体的构建

将克隆得到的启动子与增强绿色荧光蛋白EGFP基因通过OE-PCR的方法连接,构建Promoter-EGFP片段。含有EGFP的报告基因便于后续观察启动子的表达强弱。选用限制性内切酶BamH I/EcoR I与Sal I,将Promoter-EGFP片段与pRS41H质粒酶切后连接,从而得到pRS41H-Promoter-EGFP载体,质粒构建如图1所示。

图 1 重组质粒构建示意图Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

1.2.3 pRS41H-Promoter-EGFP的导入与验证

将pRS41H-Promoter-EGFP导入到大肠杆菌感受态细胞,涂布于Amp抗性的LB固体培养基上37 ℃培养过夜至长出单菌落。挑取单菌落,菌落PCR验证其是否为阳性克隆,进一步将阳性克隆过夜培养,提取质粒,质粒PCR验证是否含有目的基因片段。验证通过后即可用于后续的酿酒酵母的转化。

1.2.4 酿酒酵母的转化

提取验证后的pRS41H-Promoter-EGFP质粒,按照1∶10的比例将转化样品与感受态酿酒酵母细胞混合,转入预冷的电击杯中,冰浴5 min;转化条件为电容25 μF,电压1.5 kV,电阻200 Ω,电击时间5 ms。电击后立刻加入1 mL YPD 培养基,30 ℃孵育1 h,5 000 r/min 离心5 min,去上清。加入100 μL 1 mol/L的山梨醇重悬细胞,将其全部涂布于含有抗生素的YPD固体培养基上,30 ℃培养,观察菌落的生长情况。

1.2.5 检测荧光强度

挑取含有EGFP基因的酿酒酵母单菌落至YPD液体培养基中30 ℃,170 r/min条件下培养36 h,将2 mL菌液按比例1∶50接种于新鲜的YPD液体培养基中30 ℃,170 r/min培养,每12 h取样1次。将样品12 000 r/min离心2 min,弃上清,用PBS缓冲液重悬,再离心,弃上清,用 PBS 缓冲液将菌体稀释OD600至0.6时,取1 mL稀释后的样品加入到流式小管中,使用流式细胞仪测定酿酒酵母细胞中EGFP的荧光强度。

2 结果与分析

2.1 启动子与EGFP基因的克隆与纯化

以提取出的酿酒酵母DNA为模板,使用Taq-DNA聚合酶对启动子进行温度梯度PCR实验。克隆出从NCBI数据库上筛选出的6个启动子:PCBFI、PRTFI、PPOLI、PPOLII、PPOLII、PPAFI,启动子长度与表1查找到的数据相符,得到的PCR产物如图2(a)所示。其中A泳道为克隆得到的PCBFI,长度为515 bp;B泳道为克隆得到的PRTFI,长度为 348 bp;C泳道为克隆得到的PPOLI,长度为357 bp;D泳道为克隆得到的PPOLII,长度为371 bp;E泳道为克隆得到的PPOLIII,长度为290 bp;F泳道为克隆得到的PPAFI,长度为384 bp。对上述PCR产物进行凝胶纯化,以去除杂带DNA为后续实验的干扰,相同字母泳道代表同种启动子,纯化后的PCR产物凝胶电泳图谱如图2(b)所示。用同样的方法对EGFP基因序列进行PCR扩增,再将扩增得到的EGFP基因纯化,纯化后的凝胶电泳图如图2(c)所示,G泳道为凝胶纯化得到的EGFP报告基因,长度为798 bp。凝胶电泳显示所有目的基因均在对应的位置出现明显DNA条带,即证明得到目的基因。

2.2 启动子与EGFP报告基因载体构建

通过报告基因来验证启动子的强弱是一种常用的方法,尤其是EGFP[25-26]。利用EGFP作为报告基因,具有检测方便、无毒害、易于构建载体和活细胞定时定位观察的优点。将纯化后的EGFP报告基因通过OE-PCR技术与启动子基因序列连接,得到Promoter-EGFP基因片段。选用BamH I/EcoR I与Sal I限制性内切酶,对凝胶纯化后的高纯度的Promoter-EGFP基因片段以及质粒pRS41H酶切,并使用T4连接酶连接切后的2个基因片段,将连接产物转入感受态大肠杆菌后,进行菌落PCR验证。大肠杆菌菌落PCR如图3所示,其中图3(a)～(f)分别为重组质粒:pRS41H-PCBFI-EGFP、 pRS41H-PPAFI-EGFP、pRS41H-PPOLI-EGFP、pRS41H-PPOLII-EGFP、pRS41H-PPOLIII-EGFP和pRS41H-PRTFI-EGFP的大肠杆菌菌落PCR凝胶电泳图谱,筛选PCR反应中的阳性克隆,由图3可知6株重组酿酒酵母中重组质粒均转化成功。测序后,6组重组质粒均可用于后续酿酒酵母的转化。

2.3 载体转化及启动子表征

将验证过的pRS41H-Promoter-EGFP载体通过凝胶纯化,使用电转化法将上述连接得到的6个pRS41H-Promoter-EGFP载体转入酿酒酵母后做菌落PCR确定目的基因已成功转入。通过荧光显微镜观察转入后的酿酒酵母,镜检结果如图4所示。可以看出,6个重组酵母细胞均能观察到明显的荧光,这说明6株重组酵母菌株中的绿色荧光蛋白基因表达。

(a) pRS41H-PCBFI-EGFP (b) pRS41H-PPAFI-EGFP

为定量分析启动子强度,使用流式细胞仪对酿酒酵母细胞中的荧光强度进行定量分析,测量结果如图5所示。

图 5 重组酵母荧光强度Fig.5 Fluorescence intensity of recombinant S.cerevisiae

可以看出,启动子对报告基因的相对转录强弱依次为PPOLI>PPAFI>PPOLIII>PPOLII>PRTFI>PCBFI,且PPOLI相较于其他5个启动子具有显著性差异。根据启动子相对转录强度的显著性,可以将这6个启动子划分为不同强度类型的启动子:PPOLI为强启动子,PPAFI、PPOLIII、PPOLII为中等强度启动子,PRTFI、PCBFI为弱启动子。不同强度启动子在调控代谢途径,平衡代谢流中的均具有潜在应用价值。如,SHEN等通过使用不同表达强弱的启动子优化了酿酒酵母甲羟戊酸途径,以平衡甲羟戊酸途径中顶部和底部基因的表达,进一步提高了番茄红素的产量[27]。但是强启动子可以通过提高其下游调控基因转录水平,进而调控下游基因高表达的能力,是上调代谢途径中关键酶基因表达水平的重要调控元件[28]。所以,在代谢工程和合成生物学中对于要增加某一代谢途径的代谢流时,强启动子显示出更重要的作用,具有更大的应用价值。这也表示PPOLI作为酿酒酵母中的调控元件,相较于其余启动子具有更大的潜能。因此,研究启动子转录强弱随底盘细胞生长的变化具有十分重要的意义,选择pRS41H-PPOLI-EGFP进行后续实验。

2.4 PPOLI启动子强度随酵母细胞生长的变化

根据图5,酿酒酵母启动子PPOLI荧光强度最高,遂选取pRS41H-PPOLI-EGFP,研究荧光强度随细胞生长的变化情况,每12 h测1次,持续180 h。图6所示即为流式细胞仪测定的重组酿酒酵母的平均荧光强度随细胞生长的变化。

图 6 PPOLI重组酿酒酵母荧光强度检测Fig.6 The fluorescence intensity of recombinant S.cerevisiae of PPOLI

从图6可以看出,荧光强度随着细胞的生长逐渐增强,最终维持在较高的转录水平。在12～24 h阶段,荧光强度随酿酒酵母生长增长速度最快,随后生长速率放缓,与上一阶段持平。酿酒酵母是合成生物学中最常用的真核底盘宿主细胞,启动子作为合成生物学中的核心元件,在基因精准高效表达调控,代谢通路平衡方面发挥重要作用。WANG等利用强启动子改造链霉菌底盘细胞,从而过量表达所需基因,提高工程链霉菌产物产量[29]。而启动子PPOLI随着酿酒酵母的生长,强度趋于某一水平并能持续表达,说明该启动子可用于酿酒酵母底盘细胞中,作为酿酒酵母工厂产品质量和稳定产出的保障,从而在一定程度上可以为酿酒酵母工厂中启动子的选择和构建提供理论依据。

3 结 语

通过比对NCBI数据库,成功筛选出酿酒酵母细胞中的6个启动子,分别为:PCBFI、PPAFI、PPOLI、PPOLII、PPOLIII、PRTFI。利用OE-PCR和酶切构建pRS41H-Promoter-EGFP表达载体,并电击转入酿酒酵母细胞中。利用流式细胞术,测定各工程酵母的荧光表达强度,其中表达强度最高的为PPOLI,且明显高于其他5个启动子。此外,为了探究启动子的表达强度随酵母细胞生长的变化,以pRS41H-Promoter-EGFP工程酵母为研究对象,每隔12 h测其荧光表达强度,结果表明,启动子随着酿酒酵母的生长,表达强度也会随之增强,并在180 h左右趋于稳定,维持在较高的转录水平。这些结果为构建酿酒酵母菌株在实际条件下进行高效生物生产提供了参考。