枇杷果实采前皱缩的转录组分析

常晓晓 彭程 陈慧琼 陆育生 邱继水

摘    要：【目的】了解早鐘6号枇杷果实采前遇到高温天气出现皱缩现象的分子机制，为培育抗皱缩枇杷品种奠定理论基础。【方法】以易皱缩的早钟6号枇杷果实和抗皱缩的思贺大果枇杷果实为材料，对早钟6号枇杷采前不同皱缩程度的果实（正常果ZZS1、轻度皱缩果ZZS2和皱缩果ZZS3）进行生理生化指标分析，并对思贺大果枇杷和早钟6号枇杷果实进行转录组测序，分析早钟6号枇杷不同程度皱缩果实之间以及与思贺大果枇杷之间的差异基因表达情况，筛选与枇杷果实皱缩相关的基因。【结果】早钟6号枇杷皱缩果（ZZS2、ZZS3）与正常果（ZZS1）相比，丙二醛和脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性均显著升高。对转录组测序结果分析发现，可能与枇杷果实采前皱缩相关的基因主要参与植物激素信号转导途径、苯丙烷生物合成途径、淀粉和蔗糖代谢途径、油菜素内脂生物合成和信号转导等代谢途径。参与苯丙烷生物合成的12个基因中，有9个与木质素合成相关，在DG vs ZZS1比较中均上调表达；参与植物激素信号转导途径的13个基因中，有6个（2个GH3和4个SAUR）参与生长素信号转导；2个基因（EVM0023097和EVM0032997）参与油菜素内脂生物合成途径，在DG vs ZZS1、ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3三组比较中表达量均上调；NAC转录因子基因在ZZS1 vs ZZS2、ZZS1 vs ZZS3、ZZS2 vs ZZS3三组比较中表达量均上调。结果表明，生长素和油菜素内脂这两种植物激素可能参与枇杷果实采前皱缩过程，木质素合成相关基因可能与不同枇杷品种应对高温抗皱缩能力有关，NAC转录因子可能参与调控枇杷果实皱缩相关基因的表达。【结论】木质素可能与枇杷不同品种应对高温胁迫的能力相关，生长素和油菜素内脂可能在枇杷果实应对高温胁迫的过程中起作用。

关键词：枇杷；果实；皱缩；高温；转录组

中图分类号：S667.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）07-1342-12

Transcriptome analysis of pre-harvest fruit shrinkage in loquat

CHANG Xiaoxiao， PENG Cheng， CHEN Huiqiong， LU Yusheng， QIU Jishui*

（Institute of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affair/Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Tree Research， Guangzhou 510640， Guangdong， China）

Abstract： 【Objective】 The objective of the experiment is to understand the molecular mechanism of fruit shrinkage of Zaozhong 6 loquat when it was encountering high temperature before harvest， so as to lay a theoretical foundation for cultivating anti-shrinkage loquat varieties. Pre-harvest fruit shrinkage is affected by environmental factors， varieties and hormone levels in the tree. There are few studies on the molecular mechanism of pre-harvest fruit shrinkage and the screening and cultivation of anti-shrinkage varieties. A pre-harvest non-wrinkling loquat variety Sihedaguo was screened out from the resource nursery by our research group. It was used as an anti-wrinkling variety that was compared with Zaozhong 6 to preliminarily analyze the molecular mechanism of the difference in anti-wrinkling ability among the varieties. 【Methods】 Zaozhong 6 （easy to wrinkle） and Sihedaguo （anti-winkling） loquat fruits were selected as the materials. The physiological [malonaldehyde （MDA） and proline] and biochemical [superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD）] indexes of pre-havest Zaozhong 6 loquat fruits with different shrinkage degrees （normal fruit labeled as ZZS1， slightly shrunken fruit as ZZS2 and shrunken fruit as ZZS3） were analyzed. Transcriptome sequencing of Sihedaguo （DG） and Zaozhong 6 loquat fruits with different shrinkage degrees was carried out. The differentially expressed genes among different degrees of shrunken fruits of Zaozhong 6， and differentially expressed genes between Sihedaguo and Zaozhong 6 normal fruits were analyzed， so as to screen the genes related to fruit shrinkage in loquat. 【Results】 Compared with the normal fruit （ZZS1）， the contents of MDA and proline， and the activity of SOD and POD in the shrunken fruits （ZZS2， ZZS3） of Zaozhong 6 significantly increased. The content of proline and the activity of POD in ZZS3 increased by 81.9% and 94.5%， respectively compared with ZZS1. Four groups of samples （DG， ZZS1， ZZS2 and ZZS3） were subjected to transcriptome sequencing analysis. A total of 76.26 Gb Clean Data was obtained， and the percentage of Q30 bases in each sample was greater than 90%. Compared with ZZS1， there were 4245 differentially expressed genes in ZZS3， of which 2265 were up-regulated and 1980 were down-regulated. In order to screen the key genes affecting the shrinkage of Zaozhong 6 loquat， Venn diagram and differential expression gene analysis were carried out with the comparison of ZZS1 vs ZZS2， ZZS1 vs ZZS3 and ZZS2 vs ZZS3， and 27 common differentially expressed genes were found， of which 20 were up-regulated and 4 were down-regulated in all the three groups. According to the KEGG annotation， these genes are mainly involved in the brassinolide signal transduction pathway， terpenoid biosynthesis pathway， starch and sucrose metabolism pathway， fat metabolism pathway and plant hormone signal transduction pathway. It was found that NAC transcription factor was up-regulated in the three groups， indicating that it may be involved in the regulation of loquat fruit shrinkage-related gene expression. There were 1647 differentially expressed genes between ZZS1 and DG， of which 1028 were up-regulated and 619 were down-regulated. These genes were all differentially expressed genes between the two varieties， and some of them may not be related to the response of fruit shrinkage to high temperature. In order to further screen the genes related to the anti-shrinkage ability of loquat fruit， Venn diagram analysis was carried out in the three groups of DG vs ZZS1， ZZS1 vs ZZS2 and ZZS1 vs ZZS3， and 481 common differentially expressed genes were found in the three groups. According to COG functional classification， these genes are mainly involved in carbohydrate transport and metabolism， lipid transport and metabolism， cell wall/ membrane biosynthesis， secondary metabolite synthesis， transport and decomposition， signal transduction and defense mechanisms. According to KEGG classification， these genes are mainly involved in starch and sucrose metabolism， plant hormone signal transduction， phenylpropanoid biosynthesis （mainly involved in lignin synthesis）， glycolysis and other pathways. Among the 12 genes involved in phenylpropanoid biosynthesis， 9 were related to lignin synthesis and were up-regulated in the group of DG vs ZZS1. Among the 13 genes involved in plant hormone signal transduction pathway， 6 （2 GH3 and 4 SAUR） were involved in auxin signal transduction. Two genes （EVM0023097 and EVM0032997） were involved in the brassinolide biosynthesis pathway， and the expression levels were up-regulated in the three groups of DG vs ZZS1， ZZS1 vs ZZS2 and ZZS1 vs ZZS3. The results showed that auxin and brassinolide may be involved in the pre-harvest fruit shrinkage of loquat. Genes involved in lignin synthesis may be related to the ability of different loquat cultivars to resist high temperature and fruit shrink. 【Conclusion】 The results of transcriptome sequencing showed that the genes that may be related to the pre-harvest fruit shrinkage of loquat were mainly involved in plant hormone signal transduction pathway， phenylpropanoid biosynthesis pathway， starch and sucrose metabolism pathway， brassinolide biosynthesis and signal transduction pathway. NAC transcription factor may be involved in the regulation of gene expression related to loquat fruit shrinkage. Lignin may be related to the ability of different loquat varieties to cope with high temperature stress， and auxin and brassinolide may play a role in the process of loquat fruit to resist high temperature stress.

Key words： Loquat; Fruit; Shrinkage; High temperature; Transcriptome

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）为蔷薇科枇杷属植物中的普通枇杷栽培种[1]，属于亚热带常绿果树，果实于春末夏初成熟，在广州3月上旬至4月初成熟。早钟6号枇杷是中国第一个杂交育成的推广面积最大的枇杷品种[2]，经1999年引入广东省栽培，因果实品质优良、早结丰产性好，目前已成为广东省枇杷主栽品种之一[3]。然而在果实成熟期，如遇高温天气，早钟6号枇杷果实易出现果皮皱缩现象，严重影响了果实品质和经济效益。郑少泉[4]的研究表明，枇杷果实成熟后期遇高温干旱强日照，果面温度升高，水分供应不足，容易造成萎蔫，往往在2～3 d的高温晴天后发生大量果皮皱缩现象。王荔等[5]研究了早钟6号枇杷果实皱皮的发生规律，发现皱皮现象集中发生在果实完熟前夕、果柄离层形成时。研究表明，采前柑橘果实皱缩受环境因子、品种、树体激素水平等的影响，喷施生长素能够显著降低皱缩果率[6-8]。然而采前果实皱缩相关的分子机制研究较少，早钟6号枇杷成熟期果实皱缩的相关研究鲜有报道，而对于抗皱缩品种的筛选，以及易皱缩品种与抗皱缩品种间的相关基因表达差异尚未有研究。

笔者课题组前期统计了枇杷资源圃中与早钟6号枇杷果实成熟期相近的13份枇杷种质资源的果实皱缩率，其中早钟6号枇杷果实皱缩率达19.8%，有2份种质（思贺大果枇杷和蜜糖枇杷）果实皱缩率为0，即没有出现皱缩现象。这2份种质中蜜糖枇杷的果实较小，因此笔者在本研究中选择果实较大的种质思贺大果枇杷作为抗皱缩品种，与易皱缩品种早钟6号进行比较分析，对早钟6号枇杷不同皱缩程度的果实和思贺大果枇杷进行了转录组测序分析，以期初步筛选与枇杷果实皱缩相关的基因、不同品種抗皱缩能力的差异基因以及相关的代谢通路，为进一步解析枇杷皱缩相关的分子机制，培育抗皱缩枇杷品种奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为早钟6号和思贺大果枇杷果实，果实样品采自广东省农业科学院果树研究所枇杷资源圃，采摘时间2021年3月30日，果实成熟度8～9成熟。早钟6号枇杷分3个不同的样品：ZZS1代表早钟6号正常果实，ZZS2代表早钟6号轻度皱缩果，ZZS3代表早钟6号皱缩果。思贺大果枇杷果实未出现皱缩现象，采取其正常果，标记为DG，果实照片见图1。

1.2 生理指标测定方法

1.2.1 丙二醛含量 称取1.0 g枇杷果实样品，加入5.0 mL 100 g·L-1 TCA溶液，研磨匀浆后，离心收集上清液。取2.0 mL上清液加入2.0 mL 0.67% TBA，混合后在沸水浴中煮沸20 min，取出冷却后离心收集上清液，测定OD450、OD532、OD600，根据公式计算丙二醛含量。

1.2.2 脯氨酸含量 称取2.0 g枇杷果实样品，加入5 mL 30 g·L-1磺基水杨酸溶液研磨匀浆后转入试管中，沸水浴10 min，冷却后离心15 min，上清液即为脯氨酸提取液。吸取2.0 mL提取液于具塞玻璃试管中，加入2.0 mL冰醋酸及3.0 mL酸性茚三酮试剂，沸水浴30 min，取出冷却后加入4 mL甲苯，摇荡30 s，静置分层，取上层液测定OD520，根据标准曲线计算其含量。

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性 酶液提取：取0.1 g枇杷果实样品，按体积比1∶10加入预冷的提取液（50 mmol·L-1 pH 7.8的磷酸缓冲液）和少量的石英砂，充分研磨后，于4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min，所得上清液即可用于测定SOD活性。

SOD活性测定：依次加入0.3 ?mol·L-1核黄素0.15 mL、13 mmol·L-1甲硫氨酸2.5 mL、63 ?mol·L-1氯化硝基氮蓝四唑0.25 mL、酶液0.05 mL，混匀后，照光10～15 min后，于560 nm测定吸光值。定义在测定条件下，抑制NBT光氧化还原50%所需的酶量为1个酶活性单位（U）。

1.2.4 过氧化物酶（POD）活性 酶液提取：称取5.0 g枇杷果实样品，加入5.0 mL提取缓冲液（含1 mmol·L-1 PEG、4% PVPP和1% Triton X-100），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4 ℃，12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液。

POD活性测定：取0.5 mL酶提取液，加入3.0 mL 25 mmol·L-1愈创木酚溶液和200 μL 0.5 mol·L-1 H2O2溶液迅速混合启动反应，在反应15 s时开始测定OD470，每隔1 min记录1次，连续测定30 min，根据公式计算POD活性。

1.3 转录组测序与分析

转录组测序委托北京百迈客生物科技有限公司完成。提取枇杷ZZS1、ZZS2、ZZS3和DG果实样品RNA后，构建cDNA文库，文库构建完成后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，用Illumina平台进行测序。将下机数据进行过滤得到Clean Data，用HISAT2软件与参考基因组进行序列比对，比对分析完成后利用String Tie对比对上的reads进行组装和定量；用DESeq2进行样品组间的差异表达分析，用clusterProfiler软件（3.10.1）对差异表达基因进行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

1.4 数据分析

试验数据通过统计软件SPSS21.0进行分析，用Duncan新复极差法进行方差分析，检验差异显著性。

2 结果与分析

为了阐明早钟6号枇杷果实成熟期果实皱缩的生理及分子机制，测定了丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性，并且对早钟6号枇杷正常果、轻度皱缩果、皱缩果以及资源圃中选出的无皱缩现象的思贺大果枇杷4个样品进行了转录组测序，通过差异基因表达分析，以明确与早钟6号枇杷果实皱缩相关的基因，以及品种之间应对高温胁迫的关键差异基因。

2.1 枇杷果实在皱缩过程中的生理生化指标变化

如图2所示，早钟6号枇杷皱缩果（ZZS2、ZZS3）与正常果（ZZS1）相比，丙二醛和脯氨酸含量、SOD和POD活性均显著增加；丙二醛含量（b）由正常果的（34.46±4.1） μmol·g-1增加到（41.86±0.77） μmol·g-1；皱缩果（ZZS3）的脯氨酸含量比正常果增加81.9%，SOD活性增加了41.6%，POD活性增加了94.5%。说明在枇杷果实皱缩过程中，细胞膜脂过氧化程度加深、抗氧化酶活性增强。

2.2 枇杷果实转录组测序分析

对4组样品（ZZS1、ZZS2、ZZS3、DG）进行转录组测序分析，共得到76.26 Gb Clean Data，各样品Q30碱基百分比均大于90%；GC含量在46.7～47.9之间（表1）。进行了ZZS1 vs ZZS2、ZZS1 vs ZZS3、ZZS2 vs ZZS3、DG vs ZZS1四组比较的差异表达基因分析，如表2和图3所示，早钟6号枇杷皱缩果（ZZS3）与正常果（ZZS1）相比，有差异表达基因4245个，其中上调表达2265个，下调表达1980个。早钟6号枇杷（ZZS1）与思贺大果枇杷（DG）相比较，有差异基因1647个，其中上调表达1028个，下调表达619个。

2.3 早钟6号枇杷不同程度皱缩果与正常果之间的差异表达基因分析

为了筛选影响早钟6号枇杷皱缩的关键基因，对ZZS1 vs ZZS2，ZZS1 vs ZZS3和ZZS2 vs ZZS3三组比较进行了维恩图及差异表达基因分析（图4-A），找到3组共有的差异表达基因27个，其中20个在3组比较分析中均上调，4个均下调，3个在ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3比较中下调，在ZZS2 vs ZZS3中上调。根据COG功能分类（图4-B），这些基因参与了五大类功能，包括核苷酸运输与代谢（F，7.69%）、碳水化合物运输与代謝（G，15.38%）、脂质运输与代谢（I，7.69%）、次生代谢物合成、运输与代谢（Q，38.46%）以及一般功能类（R，30.77%）。根据GO分类，这些基因参与了信号转导、氧化还原、碳水化合物代谢、应对光刺激等生物学过程，参与细胞膜、内质网膜等组成成分，具有氧化还原酶活性、水解酶活性、纤维素酶活性、蛋白激酶活性等分子功能。

在这27个共有的差异表达基因中，有20个在3组比较中表达量均上调，4个在3组比较中表达量均下调，这些基因可能与枇杷果实皱缩高度相关。20个上调基因包括：1个丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶，根据KEGG注释，参与油菜素内脂信号转导途径；6个C1H46蛋白，根据KEGG注释，其中1个参与泛素介导的蛋白水解途径，1个参与萜类生物合成途径，其余4个未被注释到任何代谢途径（GO注释为氧化还原活性）；2个基因参与淀粉和蔗糖代谢途径；1个基因参与苯唑嗪类生物合成；其余10个未被注释到任何代谢途径（包括1个水解酶类基因，1个NAC转录因子基因，1个F-box蛋白AFR-like基因，1个ras-related蛋白基因，2个DVH24蛋白基因，1个脱水素基因，另外3个基因GO注释为细胞膜组分）。4个下调基因分别是1个GDSL酯酶/脂肪酶基因，参与脂肪代谢途径；1个富含亮氨酸重复受体蛋白激酶基因，未被注释到任何代谢途径；1个内切葡聚糖酶基因，参与淀粉与蔗糖代谢途径；1个生长素响应蛋白基因，参与植物激素信号转导途径。

这24个在3组比较中表达量一致的基因表达聚类热图（图5）显示，其中有9个基因在重复间一致性较好，包括6个上调表达的基因[EVM0002174（BR-signaling kinase，参与油菜素内脂信号转导途径）、EVM0008555（NAC转录因子基因）、EVM0012379（Zinc-binding dehydrogenase，参与氧化还原过程）、EVM0017570（Aldo/keto reductase family，参与氧化还原过程）、EVM0027280（Ras family）、EVM0039679（Dehydrin，响应水分胁迫）]和3个下调表达的基因[EVM0006727（GDSL esterase/lipase 7，参与脂肪代谢）、EVM0036225 （SAUR，参与生长素信号转导途径）、EVM0031215（endoglucanase，参与淀粉和蔗糖代谢途径）]。

结果表明，在枇杷果实皱缩过程中，生长素和油菜素内酯这两类激素可能参与调控此过程，另外碳水化合物、萜类、脂类等代谢物在枇杷果实皱缩过程中也会发生变化；在分子水平上，脱水素基因表达量变化最明显，ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3两组比较的log2FC值均＞5，在皱缩果中表达量最高；并且发现NAC转录因子在3组比较中均上调表达，说明其可能参与调控枇杷果实皱缩相关的基因表达。

2.4 早钟6号枇杷正常果与思贺大果枇杷之间的差异表达基因分析

根据前期对资源圃中与早钟6号枇杷果实同期成熟13份资源皱缩情况的统计，从中筛选出成熟后不会出现皱缩现象的思贺大果与早钟6号枇杷果实进行转录组测序分析，以期筛选出关键差异基因。如表2所示，早钟6号枇杷和思贺大果枇杷之间的差异基因有1647个，其中上调表达1028个，下调表达619个。这些基因是2个品种之间所有的差异表达基因，其中一部分可能与果实响应高温并无关系，为了进一步筛选与枇杷果实高温耐受相关的基因，对DG vs ZZS1、ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3三组比较进行了维恩图分析（图6-A），找到3组共有的差异表达基因481个，根据COG功能分类（图6-B），主要参与碳水化合物运输和代谢、脂质运输和代谢、细胞壁/膜生物合成、次生代谢物合成、运输和分解、信号转导和防御机制等。

根据KEGG分类，这些基因主要参与淀粉和蔗糖代谢途径、植物激素信号转导途径、苯丙烷生物合成途径（主要参与木质素合成）、糖酵解途径等。如图7所示，参与苯丙烷生物合成途径的12个基因中，有9个与木质素的合成相关，分别是POD（2个：EVM0030656和EVM0044868）、COMT（3个：EVM0000718，EVM0004717和EVM0043031）、CAD （EVM0015104）、CCR（EVM0022913）、4CL（EVM0033838）和F5H（EVM0043011），这9个基因在DG vs ZZS1比较中均上调表达，说明木质素可能与不同品种应对高温胁迫能力相关；而在ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3两组比较中均下调表达，说明这些基因的表达量随着早钟6号枇杷果实皱缩程度的加深而下降。

参与植物激素信号转导途径的13个基因中，有6个参与生长素信号转导，包括2个GH3（EVM0012524和EVM0032063）、4个SAUR（EVM0015711、EVM00-

31846、EVM0038736、EVM0039643）。另外，在3组共有的差异表达基因中，发现有2个基因（EVM0023097和EVM0032997）参与油菜素内脂生物合成途径，这2个基因在DG vs ZZS1、ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3三组比较中表达量均上调，NR注释为cytochrome P450 90A1-like（CYP90A1）。

3 讨 论

3.1 早钟6号枇杷果实皱缩过程中抗逆指标变化明显

早钟6号枇杷果实随着皱缩程度加深，丙二醛含量、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性等抗逆指标升高。研究表明，丙二醛含量是反映细胞膜损伤程度的指标，高温胁迫下，膜脂过氧化程度加深，细胞膜透性丧失，产生大量丙二醛等过氧化产物[9-10]；同时由于高温逆境造成超氧阴离子自由基增加，导致体内活性氧积累，诱发SOD、POD等抗氧化酶类活性升高[11-12]。脯氨酸在逆境下，可以平衡细胞代谢、维持细胞结构的完整性，多种果树遇温度胁迫，脯氨酸含量会大量增加[13-15]。在广州地区，早钟6号枇杷成熟期会遇到35～42 ℃的高温，因此笔者推测，早钟6号枇杷果实成熟期果皮皱缩，响应逆境指标变化明显，可能是成熟期高温胁迫所致。

3.2 生长素和油菜素内脂可能参与枇杷果实皱缩过程

根据早钟6号枇杷不同皱缩程度果实的转录组分析，以及早钟6号枇杷与思贺大果枇杷的转录组比较分析，发现有6个差异基因（4个SAUR和2个GH3）参与生长素信号转导，其中有2个在皱缩果中表达量上调，4个下调，说明生长素可能参与调节枇杷果实高温皱缩过程。Li等[6]的研究表明，Zn+NAA处理提高了砂糖橘果实生长素水平，减少了皱缩果率和落果率。高温胁迫能够诱导生长素的合成以及生长素信号响应基因SAUR的表达[16-17]。番茄SLSAUR3、16、71、36等基因在高温胁迫条件下表达量显著下降[18]。王红飞等[19]对黄瓜SAUR基因家族的研究表明，CsaSAUR1、CsaSAUR13、CsaSAUR15、CsaSAUR49、CsaSAUR50等5个基因受高温诱导表达量增加。柑橘SAUR基因家族中CclSAUR39的表达受低温胁迫的诱导，其对温度胁迫敏感[20]。Chen等[21]对枇杷果实受高温胁迫不同时间后的转录组测序分析，发现有58个差异表达基因参与生长素信号转导途径，其中有多个SAUR和GH3基因，说明生长素信号转导途径在枇杷应对高温胁迫过程中起到关键作用。

另外，笔者在本研究中发现2个差异基因参与油菜素内脂生物合成途径，在早钟6号枇杷皱缩果中的表达量高于其正常果，在抗皱缩果品種思贺大果枇杷中的表达量低于早钟6号枇杷，说明枇杷果实中油菜素内脂可能参与调节果皮应对高温出现皱缩的程度。研究表明，油菜素内脂参与植物应对干旱、高温、冻害等非生物胁迫，提高抗氧化防御系统的能力，同时通过提高渗透调节物质脯氨酸的含量缓解逆境对植物的伤害[22-27]；高温能够通过诱导PIF4和HY5转录因子调控油菜素内脂的合成，进而促进植株生长[28-29]。笔者在本研究中发现，油菜素内脂合成关键酶基因CYP90A1在DG vs ZZS1、ZZS1 vs ZZS2和ZZS1 vs ZZS3三组比较中表达量均上调，说明其可能参与响应高温胁迫信号，进而影响枇杷果实中油菜素内脂的水平，以应对温度胁迫。

3.3 木质素合成代谢途径与枇杷果实皱缩相关

对抗皱缩种质思贺大果枇杷和易皱缩早钟6号枇杷及其不同程度皱缩果的转录组分析，发现差异表达基因中有9个参与木质素合成（POD 2个，COMT 3个和CAD、CCR、4CL、F5H各1个），与思贺大果枇杷相比，这些基因在早钟6号枇杷中表达量上调，说明木质素含量及单体组分可能与不同品种抵抗高温胁迫的能力有关。李雪等[30-31]对枇杷果实木质化相关基因的功能分析发现，EjPAL和Ej4CL基因的表达水平与木质素含量呈正相关，瞬时过量表达Ej4CL1能够诱导烟草叶片木质素合成。而木质素合成下游基因COMT、CAD的差异表达则会影响木质素单体组分的含量[32-33]，EjCAD1的表达水平与果实木质化程度呈正相关[34]。枇杷果肉木质化研究较多的是在果实采后贮藏衰老的过程中果实出现质地生硬粗糙少汁的现象，可能与贮藏过程中发生冷害相关[35-37]。Shan等[34]的研究发现，低温条件下，易发生木质化的枇杷品种洛阳青果实中的POD表达水平显著高于不发生木质化的品种白沙。低温处理能够诱导枇杷果实木质化，并伴随着CAD活性的升高及EjCAD3和EjCAD5基因表达量的增加[38]。本研究中木质素合成相关基因在受高温影响的不同程度皱缩果实中出现差异表达，说明枇杷果实木质素的合成不仅与低温冷害有关，同样受到高温胁迫的影响。

3.4 NAC转录因子可能参与调控枇杷果实皱缩相关基因的表达

对早钟6号枇杷果实不同皱缩程度的转录组比较（ZZS1 vs ZZS2、ZZS1 vs ZZS3、ZZS2 vs ZZS3）分析发现，NAC转录因子基因在3组中表达量均上调，说明其可能参与调控枇杷果实皱缩相关的基因表达。研究表明NAC转录因子参与果实成熟衰老过程[39]，如番茄突变体nor的果实不能正常成熟，其原因是NAC结构域的基因不能正常表达[40]；citNAC与奉节脐橙晚熟突变体的果实成熟及组织衰老密切相关[41]；草莓NAC转录因子调控细胞凋亡及衰老，导致采后草莓果实衰老[42]。本研究中，早钟6号枇杷果实皱缩现象主要发生在成熟后期，其皱缩过程与果实成熟衰老过程一致，随着皱缩程度加重，NAC转录因子基因表达量增加，说明其可能参与调控这一过程。研究表明，NAC转录因子调控枇杷果实木质化，转录因子EjNAC对木质素合成基因Ej4CL1具有转录激活效应[43]，EjNAC3能与EjCAD-like基因启动子结合并激活其表达[44]。本研究中，木质素合成基因在枇杷不同程度皱缩果实中出现差异表达，说明NAC转录因子有可能在枇杷果实皱缩过程中参与调控木质素合成相关基因的表达。

4 结 论

对早钟6号枇杷不同程度皱缩果实的转录组测序分析，发现可能参与调控这一过程的基因主要有24个，包括丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、C1H46蛋白、F-box蛋白AFR-like基因、GDSL酯酶基因、内切葡聚糖酶基因、NAC转录因子基因等，参与油菜素内脂信号转导途径、泛素介导的蛋白水解途径、萜类生物合成、脂肪代谢、淀粉与蔗糖代谢以及植物激素信号转导途径。对思贺大果枇杷与早钟6号枇杷不同程度皱缩果实的转录组比较分析发现，9个与木质素合成相关的基因在DG vs ZZS1比较中均上调表达，说明木质素可能與不同品种应对高温胁迫能力相关；在3组共有的差异表达基因中发现，6个基因参与生长素信号转导，2个基因参与油菜素内脂生物合成途径，说明生长素和油菜素内脂这两种激素可能参与调控枇杷果实应对高温胁迫的过程。

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