功能蛋白酶催化及应用进展

周北雅,郭艳东,薛雅鞠,袁江月,纪秀玲,李 壮,黄玉红,3

(1.渤海大学 数学科学学院,辽宁 锦州 121000;2.中国科学院 过程工程研究所,北京 100190;3.中国科学院 绿色过程制造创新研究院,北京 100190)

蛋白酶不仅能够在较宽的pH和温度范围内将蛋白质肽链水解成可溶的短肽和游离氨基酸,而且在各种表面活性剂、氧化剂、漂白剂、增白剂和有机溶剂等体系中具有稳定性[1],所以对洗涤、皮革、纺织、饲料、食品和医药等领域的发展有着重要的意义[2-3]。

蛋白酶来源丰富,广泛存在于动物、植物和微生物体内,其中,微生物由于其生长周期短、生产成本低,可以连续供应所需的产品,已成为蛋白酶商业生产的首选[4]。微生物蛋白酶几乎占据着全球商业蛋白酶市场的三分之二[5]。在工业酶中,蛋白酶是占比最大的工业生物催化剂,根据MarketsandMarkets的数据,2020年世界工业酶市场价值为59亿美元,预计2026年将达到87亿美元,年复合增长率为6.5%[6]。预计到2027年,全球蛋白酶市场的规模将达到27亿美元,我国的市场规模预计将达到5.505亿美元,年复合增长率为7.6%;其他国家,如日本和加拿大,预计在2020年至2027年期间,年复合增长率分别为2.7%和4.4%,而德国将以约3%的复合年增长率增长[7]。随着酶在食品和饮料行业应用的发展,预计到2026年,食品领域将占领酶应用市场的最大份额[8]。因此,本文主要对蛋白酶的来源、功能、催化机制、酶工程改造、基因工程菌株构建和应用进行综述,以期为相关的科研工作和生产企业提供参考。

1 功能蛋白酶的微生物来源及分类

目前,产蛋白酶的微生物包括细菌、真菌以及放线菌[9],它们可利用不同的底物生产不同功能的蛋白酶。微生物菌株所生产蛋白酶的种类主要取决于生产环境,如,在屠宰场、肉类和家禽加工厂附近的土壤环境中的细菌具有生长周期短、对生长环境要求低、代谢过程特殊以及所产蛋白酶活性高等优点[10-11],因此,从这些环境中筛选的微生物被广泛应用在工业酶生产中。

一般来讲,细菌生产蛋白酶的最适pH为6.0～9.0、最适温度为30～50 ℃[12]。芽孢杆菌属因其较强的蛋白酶分泌能力,目前已成为蛋白酶最重要的细菌来源[13]。真菌是最早被发现可以生产蛋白酶的微生物,特别是一些非致病性真菌生产的蛋白酶应用十分广泛,如黑曲霉(A.niger)[14]、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)[15]、金孢属(Chrysosporium)[16]、石膏小孢子菌(Microsporumgypseum)以及镰刀菌(Fusariumsolani)[17]等。虽然有些真菌可以高效分泌蛋白酶,但是它们会破坏人体以及动物的皮肤外层角蛋白,引发疾病,因此限制了这些致病菌株的商业应用。可以产生蛋白酶的放线菌菌株,主要包括链霉菌属(Streptomycessp.)[18]和热放线菌属CDF(Thermoactinomycessp.CDF)[19]。Jaouadi等[20]发现,链霉菌属AB1(Streptomycessp. AB1)产生的蛋白酶可完全降解羽毛,并且对洗涤剂和有机溶剂都表现出较强的稳定性和较高的耐受性[20]。

经过几十年的发展,我国蛋白酶的生产技术已经逐渐成熟,并初具规模。目前国内大部分商业蛋白酶主要是高温耐碱性。另外,由于蛋白酶独特的催化活性,目前已经广泛应用于食品、医疗、纺织、皮革等传统行业,发展前景十分广阔。但是,我国蛋白酶行业相对于国外起步较晚,与国际水平相比还有较大差距,仍需要进一步研究与探索。表1总结了目前商业蛋白酶的种类、来源、反应条件和应用范围等。

表1 商业蛋白酶

2 蛋白酶的分类

由于蛋白酶来源广泛,所以理化性质也不尽相同,根据功能及催化特性、pH特性或催化作用位点的不同,蛋白酶可以被分成不同的类型[21]。

2.1 根据蛋白酶的功能及催化特性分类

根据蛋白酶的功能及催化特性,可将其分为9个家族,分别是天冬氨酸蛋白酶(A)、半胱氨酸蛋白酶(C)、谷氨酸蛋白酶(G)、金属蛋白酶(M)、天冬酰胺酸蛋白酶(N)、混合蛋白酶(P)、丝氨酸蛋白酶(S)、苏氨酸蛋白酶(T)和未知功能的蛋白酶(U)[42]。

2.1.1 天冬氨酸蛋白酶

天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.-),是一类酸性蛋白酶,在酸性(pH 3.0～4.0)条件下仍有活性,广泛分布于真菌、植物和脊椎动物以及艾滋病病毒(HIV)逆转录病毒中[43],主要参与机体的新陈代谢以及生物调控。它的酶活性中心由2个催化性天冬氨酸残基Asp32和Asp215组成。该蛋白酶分为3个家族,即胃蛋白酶、胃蛋白酶反转录酶和逆转录病毒蛋白[44]。天冬氨酸蛋白酶的分子量通常为(3.5～5.0)×104,由320～340个氨基酸残基组成。目前从酵母菌和真菌中提取的天冬氨酸蛋白酶已被纯化和克隆并用于实验研究和工业生产中,包括米曲霉(A.oryzae)、烟曲霉(A.fumigatus)和黑曲霉(A.niger)等[45]。

2.1.2 半胱氨酸蛋白酶

半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4.22.-),其催化作用依赖于活性位点的半胱氨酸残基,酶活性中心一般由His、Cys和Asp组成,分子量为(2.0～3.5)×104、最适pH为4.5～7.0、最适温度为50～70 ℃[46],其中木瓜蛋白酶是最常见的半胱氨酸蛋白酶[47]。由于巯基极易被氧化,半胱氨酸蛋白酶只有在还原剂存在的情况下才具有活性,所以许多半胱氨酸蛋白酶在其反应介质中需要添加还原剂。迄今为止,已经鉴定了11种人类半胱氨酸组织蛋白酶,包括B、C、F、H、L、O和X,它们普遍存在于人体所有结构中,另一些则仅限于特定的细胞或组织中进行特异反应,如蛋白酶K、S、V和W[48]。半胱氨酸蛋白酶在生物体的生理代谢和发育的各个方面都发挥着重要的作用：在植物体内,它参与植物细胞调控的多个过程,如,细胞的死亡、调控贮藏蛋白积累、器官衰竭、管状细胞分化和细胞内蛋白质周转等[48];在动物和人类体内,它们负责调控细胞衰老和凋亡、激素前处理等[49]。

2.1.3 金属蛋白酶

金属蛋白酶(EC 3.4.24.-),特指活性中心含有金属离子的蛋白酶,最适pH为5.0～9.0。目前已经确定的金属蛋白酶家族大约30个,其中17个家族只含有内肽酶、12个家族只含有外肽酶、1个家族同时含有内肽酶和外肽酶。它的酶活性中心由His-Glu-Xaa-Xaa-His组成。金属蛋白酶的代表是嗜热菌蛋白酶,其中组氨酸残基为锌提供配体,谷氨酸残基则直接参与催化功能[50]。金属蛋白酶可以被乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA)等螯合剂抑制[46],但对半胱氨酸抑制剂或巯基不敏感。

2.1.4 丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.-),是最有特色的一类蛋白酶,已鉴定出700多种丝氨酸蛋白酶,是自然界中最丰富的酶之一。丝氨酸蛋白酶的活性中心都含有必需氨基酸残基Ser-His-Asp催化三联体,它们分布在活性位点的两侧,一侧是Ser195,另一侧是Asp102和His57[51],几乎三分之一的蛋白酶都可以归类为丝氨酸蛋白酶[52]。在MEROPS database中,根据催化机制可将丝氨酸蛋白酶分为13个家族[53]。最典型的3种丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶参与血液凝固、食物消化、防御机制、免疫反应和组织重组等生理过程。在医学领域,它主要用于治疗止血和血栓形成、皮肤病、炎症治疗及病毒感染等方面,而工业,它主要应用于洗涤剂和食品等行业[54]。丝氨酸蛋白酶在生物体的代谢过程中发挥着举足轻重的作用。随着合成生物学、宏基因组学和蛋白质组学的不断发展与进步,丝氨酸蛋白酶在未来会得到更多的关注,会有更广泛的应用。

2.1.5 苏氨酸蛋白酶

苏氨酸蛋白酶(EC 3.4.25.-),是一种新型蛋白酶,在活性中心的苏氨酸残基对其催化机制有重要作用,与丝氨酸蛋白酶具有相似的催化特性,产自细菌、古细菌或真核生物。N端苏氨酸的羟基充当蛋白水解亲核基团[55]。苏氨酸蛋白酶基因在基因组中出现的频率比丝氨酸蛋白酶基因低1.1%;因为20S蛋白酶体和26S蛋白酶体被认为是苏氨酸蛋白酶前体,20S和26S蛋白酶体在古细菌和真核生物中都可以快速降解蛋白质,能够在多个位点切割多肽生成短肽,其中95%的短肽长度小于20个氨基酸残基[56]。

2.1.6 谷氨酸蛋白酶

谷氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.19)是一种酸性蛋白酶,此类酶所有活性中心都含有一个谷氨酸残基,与枯草杆菌蛋白酶结构具有相似性[57]。当以酪蛋白为底物时,其最适pH为2.0。谷氨酸蛋白酶是由2个反向平行的β-折叠组成的三维结构,包含2个独特的催化二联体Gln53和Glu136残基。目前,已经从很多菌株中分离出谷氨酸蛋白酶,如,踝节菌(Talaromycesemersonii)、担子菌(Phanerochaetechrysosporium)和核盘菌(Sclerotinasclerotiorum)等[58]。

2.2 根据蛋白酶催化的pH范围分类

根据蛋白酶表现出较高活性的pH范围,可将蛋白酶分为3类：酸性蛋白酶(pH 2.0～6.0)、中性蛋白酶(pH 6.0～8.0)和碱性蛋白酶(pH 8.0～13.0)[59]。酸性蛋白酶在酶活性中心含有一个或多个羧基,其中最具代表性的是胃蛋白酶。中性蛋白酶属于内切酶的一种,可将大分子蛋白水解为氨基酸,且反应条件温和,是目前用于蛋白质水解处理的一类重要的蛋白酶。碱性蛋白酶,当它具有丝氨酸活性中心(在其催化中心含有Asp-His-Ser三联体),称为丝氨酸蛋白酶;当它具有催化所需的金属离子时,称为金属蛋白酶,是目前应用最广泛的一类蛋白酶[60],该蛋白酶的性能受多种因素影响,如pH、离子强度和温度等[61]。

2.3 根据蛋白酶的作用位点分类

根据蛋白酶作用位点的位置,可将蛋白酶分为内肽酶和外肽酶,在分子内部作用非末端氨基酸残基的肽键,称为内肽酶(EC 3.4.21.-～3.4.24.-、3.4.99.-)。外肽酶(EC 3.4.11.-～3.4.19.-)则是在C端或N端切割氨基酸间的肽键,外肽酶根据肽段的大小、起始肽段的末端以及肽链的长度等特性又被分为氨肽酶或羧肽酶[5]。

2.3.1 外肽酶

氨肽酶水解多肽链中N端的氨基酸,释放出单个氨基酸、二肽或三肽。氨肽酶主要存在于细胞中,存在于不同的亚细胞室,在肽激素的分解和各种酶的加工中发挥重要作用[62]。氨肽酶的最适pH为6.0～9.0,位于不同的亚细胞室,包括细胞质、溶酶体和细胞膜,也可以分泌到细胞外介质中。氨肽酶是一种具有很高应用价值的生物催化剂,通过定点诱变和重组DNA技术,可提高氨肽酶的特异性和稳定性,高活性氨肽酶在各个工业领域应用广泛[63]。

羧肽酶主要水解肽链C端的氨基酸,释放单一氨基酸或二肽。根据活性中心残留氨基酸的特征,羧肽酶主要包括3类：丝氨酸羧肽酶、半胱氨酸羧肽酶和金属羧肽酶。羧肽酶的主要来源包括动物、植物和微生物,其中动物来源主要是猪或牛的胰腺,植物来源是小麦、水稻和番茄等,微生物来源主要是酵母、曲霉菌等[64]。

2.3.2 内肽酶

内肽酶,也就是通常所说的蛋白酶,主要作用于蛋白质多肽链内部的肽键,使蛋白质长链分解成短肽片段。内肽酶根据主要负责催化活性基团的反应类型进一步分类,主要包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和苏氨酸蛋白酶[65]。

3 功能蛋白酶的催化机制

功能蛋白酶分子作用机制不仅对蛋白酶理性和半理性设计改造至关重要,同样对蛋白酶应用领域的拓展具有重要意义。目前,蛋白酶的分子作用机制的研究成果并不多,因此本文总结部分蛋白酶的催化机制。

3.1 天冬氨酸蛋白酶催化机制

天冬氨酸蛋白酶主要由β链二级结构组成,β链位于活性位点的底部,包含一对天冬氨酸残基,在2个天冬氨酸羧基之间有一个氢键水分子,参与催化反应[66],大部分的天冬氨酸蛋白酶至少有一个β发夹结构区域(图1(a))[45,67]。图1(b)则解释了天冬氨酸蛋白酶的作用机制。

1)水分子通过氢键与两个天冬氨酸残基结合,并作为亲核试剂攻击肽键的羰基碳。天冬氨酸残基Asp218作为碱,夺取水分子的质子H+,随后H2O上的O作为亲核试剂攻击底物肽键上的羰基;同时天冬氨酸残基Asp32向肽键的羰基氧提供质子H+,形成四面体中间体。

2)天冬氨酸残基Asp218上的质子H+转移至底物肽键的N原子上,使得底物的“剪刀状”构型发生转变;同时天冬氨酸残基Asp32上的质子转移至底物肽键的羰基氧上,导致底物肽键中的C—N键断裂,生成2种产物,并生成带负电的天冬氨酸残基Asp218用于后续的催化过程[45]。

3.2 半胱氨酸蛋白酶催化机制

半胱氨酸蛋白酶的催化机制基本上有2个主要步骤,酰化和脱酰化(图2)[68]：①His159上N原子上的孤对电子与Cys25上S—H形成离子键,夺取质子H+,形成质子化的His159;②失去质子H+的Cys25,亲核进攻底物肽键上的羰基碳,形成一个四面体的中间体;③质子化的His159的质子转移到四面体中间体的N原子上,并断裂C—N键,形成伯胺和另一种酰化中间产物,在这个过程中,这两步可以分步进行,也可以同时进行;④His159上的N原子夺取分子上的质子并形成OH-,OH-亲核进攻酰化中间产物上的羰基碳脱酰化,最终生成两种脱酰化产品。

图2 半胱氨酸蛋白酶的催化机制[68]Fig.2 Catalytic mechanism of cysteine protease[68]

3.3 丝氨酸蛋白酶的催化机制

丝氨酸蛋白酶的催化机制[69]如图3所示。①丝氨酸蛋白酶上的Ser残基上的—OH官能团被“碱”夺取质子,作为亲核试剂进攻底物肽键上的羰基碳,形成带有负氧离子的四面体中间体;②被“碱”夺取的质子转移至肽键的N原子上,且C—N键断裂,形成氨基产物和酰化中间产物;③酰化的中间产物作为“碱”进一步夺取H2O的质子H+,去质子化的H2O亲核进攻酰化中间产物的羰基碳,形成带有氧负离子的脱酰化中间产物;④氧负离子通过电子转移导致Ser残基上的O原子与底物C原子之间的C—O键断裂,形成羧基产物以及丝氨酸蛋白酶的再生。

图3 丝氨酸蛋白酶催化机制[69]Fig.3 Catalytic mechanism of the serine protease[69]

3.4 蛋白酶去除蛋白污渍的作用机制

蛋白酶加入洗涤剂可去除血迹污渍,在洗涤过程中,红细胞在水和洗涤剂的混合物中溶解,红细胞中的血红蛋白和其他蛋白质被释放出来,洗涤剂中加入的蛋白酶,将血红蛋白中的珠蛋白和其他大蛋白水解成多肽,多肽在水中的溶解性能较好,进而可去除血迹[70]。相关的文献也证实了该观点,具体机制如图4所示[5,71]。

图4 蛋白酶去除蛋白污渍的作用机制[5,71]Fig.4 Mechanism of protease in removing protein stains[5,71]

3.5 蛋白酶降解角质的作用机制

角质废弃物(如羽毛、猪毛等)含有大量的蛋白质(>90%),但是结构复杂(含有大量的二硫键、氢键和范德华力等作用),其二级结构的后翻译修饰过程(如糖基化和磷酸化等),增加了其生物抗性,很难被降解。Huang等[72]利用基因组、分泌组等手段,对丝状真菌O.corvina、细菌Bacillus等进行分析并结合异源表达及蛋白的分离纯化技术发现了7种新的高效降解角质蛋白酶系,包括内切蛋白酶(S8),外切蛋白酶(M28)和寡肽酶/金属蛋白酶(M3)、AA11多糖单加氧酶(LPMOs)(图5(a))、M12、S1、T3,结果发现不同功能蛋白酶的协同作用能够有效降解角蛋白。

图5 3种蛋白酶的协同作用降解角蛋白[72]Fig.5 Keratin degraded by the synergistic action of three proteases endoprotease (S8),exoprotease (M28),oligopeptidase/metalloprotease (M3) and sulfite/disulfide reductase[72]

因为LPMOs(AA11)在丝氨酸和苏氨酸糖基化过程中破坏N-乙酰氨基葡萄糖部分之间的β-1,4键,这会导致角蛋白头部结构的电荷发生变化(图5(b))。这种变化会导致角蛋白结构解聚,有利于3种蛋白酶(S8、M28和M3)作用,并进一步将角蛋白丝降解为可溶性的短肽和氨基酸等[72]。

另外,Huang等[73]阐明了芽孢杆菌Bacillussp.8A6降解角蛋白的机制：代谢产物亚硫酸盐和金属蛋白酶M12破坏角蛋白分子结构,便于丝氨酸蛋白酶S8A进一步水解,得到的长肽再被丝氨酸蛋白酶S1A降解,最后寡肽和二肽会通过ABC转运系统转运到细胞内,这个过程中,分泌型家族T3γ-谷氨酰转肽酶为细胞提供半胱氨酸。

3.6 蛋白酶用于植物功能肽制备的作用机制

大豆中含有的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白中存在二硫键,降解困难,但是蛋白质二硫键还原酶可分解蛋白质中存在的胱氨酸二硫键,蛋白水解酶将变性蛋白质水解成肽和氨基酸[74],从而降解大豆,促进大豆中粗蛋白和氨基酸的消化。来源于牛奶、大豆和谷物的蛋白质水解物的水解基本上是通过内肽酶和外肽酶的共同作用,图6给出了蛋白质水解过程中所涉及的酶[62]。

图6 食物蛋白质水解过程中所涉及的酶[62]Fig.6 Enzymes involved in the process of food protein hydrolysis[62]

4 高效功能蛋白酶的筛选及基因工程菌株构造

尽管研究微生物蛋白酶已久,但寻找新的蛋白酶基因,构建产酶菌株仍然十分重要。从天然环境中筛选出能高产酶的野生菌株,借助高效表达菌株对该野生菌株蛋白酶基因进行表达,可有效提高蛋白酶的产量,获得高性能的蛋白酶。通过酶工程技术,可改善蛋白酶的一个或多个特性,如极端pH和温度耐受性、底物特异性和稳定性等。目前,许多革兰氏阳性菌已被用于构建高效的蛋白表达系统,包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和短芽孢杆菌[75]。

最近Yahaya等[76]总结了提高角蛋白产量的分子策略,包括质粒选择、启动子工程、染色体整合、信号肽和前肽工程及密码子优化等,为角蛋白的异源表达,构建基因工程菌株提供有益的指导。Peng等[77]基于前肽工程在枯草芽孢杆菌WB600中高效表达了地衣芽孢杆菌BBE11-1的角蛋白酶基因,再进行组合突变,获得突变酶活为原始酶(127.6 kU/mg)的186%;另外,从解淀粉芽孢杆菌K11中克隆了中性蛋白酶编码基因Banpr,在枯草芽孢杆菌菌株WB600中构建重组质粒pUB110-Banpr并成功表达,在摇瓶中酶活可达(8 995±250) U/mL;进一步优化发酵条件,在15 L发酵罐中,酶活达到28 084 U/mL,远高于广泛使用的工业菌株枯草芽孢杆菌AS.1398,这可用于规模化生产和工业应用中[78]。

虽然构建基因工程菌株生产功能蛋白酶的技术已经趋于成熟,但是目前我国蛋白酶生产方面仍然存在一些问题：①在蛋白酶生产过程中缺乏高效表达系统,导致蛋白酶的工业生产表达量难以达到国际最高水平。目前功能蛋白酶的高效表达系统的构建集中于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母,而蛋白酶在这些底盘细胞中表达时仍存在蛋白表达量低和细胞生长受限等问题,限制了蛋白酶的高效表达,与工业生产的蛋白酶仍有差距。②目前缺乏高端的低温蛋白酶,且生产的蛋白酶的活性、稳定性以及抗自切的能力均有待突破。因为构建基因工程菌生产高效的功能蛋白酶大多需要在较高温度下才能高效表达出活性,且蛋白酶本身存在的自酶切性质,导致其极为不稳定。③在蛋白酶研究过程中,蛋白酶的种类和催化机制差异较大,所以蛋白的酶酶活难以用统一的标准评判。综上所述,蛋白酶的高效表达、活性及稳定性的提高以及高端低温蛋白酶的生产将是未来工业蛋白酶研究的主要方向。表2总结了近年来高效功能蛋白酶原始生产及基因工程菌株。

表2 功能蛋白酶及基因工程菌株

5 功能蛋白酶的应用

蛋白酶是三大工业酶类之一,利用蛋白酶水解蛋白比传统的化学法更加环保、反应条件更温和。一方面,传统的热化学方法条件苛刻,还会造成不稳定氨基酸(如丝氨酸、精氨酸和苏氨酸等)的降解;另一方面,一些特殊的化学品可能会造成环境污染的问题,因此利用蛋白酶的方法更受到人们的青睐[79]。迄今为止,蛋白酶在洗涤、纺织、皮革、饲料与食品、医药行业及生物能源等领域都有广泛的应用。

5.1 洗涤行业

用于洗涤剂的蛋白酶必须具备酶活性高、在一定的pH和温度范围内有足够的稳定性、与其他洗涤剂成分有高度相容性等特性[80]。丝氨酸蛋白酶的分子量为(1.8～9.0)×104,在广泛的pH范围内具有高活性和高稳定性,对底物具有的特异性。在洗涤过程中,与洗涤剂相容的蛋白酶将蛋白质污渍中的多肽链降解成可溶性肽和氨基酸,这些肽和氨基酸很容易被去除[81]。

Paul等[71]研究发现,来自依利诺斯类芽孢杆菌PaenibacilluswoosongensisTKB2的碱性蛋白酶在pH 9.0时表现出最佳活性,将该酶与洗涤剂结合后,在不改变质地的条件下,短时间内不仅可有效去除血渍,还可以去除蛋黄和巧克力的混合污渍,且不破坏纤维强度和结构,产生的污水也不会影响生态系统。Bouacem等[82]从黏金黄杆菌Caldicoprobacterguelmensissp.Nov.D2C22T中分离得到的细胞外耐热丝氨酸碱性蛋白酶SAPCG,分子量为5.58×104,可溶于各种商业洗涤剂,有效去除血渍。Patil等[83]从环状芽孢杆菌B.circulansMTCC 7942分离并纯化的耐高温、耐有机溶剂的碱性丝氨酸蛋白酶,最适pH为10.0、最适温度为60 ℃、分子量为4.3×104,且在有机溶剂中保持活性,可加入洗涤剂用于去除牛奶、汗液和血液等污渍。Ranakrishna等[84]将短小芽孢杆菌B.pumilusGRK产生的丝氨酸蛋白酶用作洗涤剂中的生物添加剂,在不影响纤维及其质地的情况下,成功去除了布料上的血渍,是一种无毒、环保并且可生物降解的添加剂。

蛋白酶还可用作清理下水道和排水口中堵塞的头发角蛋白的清洁剂。以角蛋白酶和非硫还原剂组合开发出一种清洁剂组合物,在安全环保的条件下,能够高效清洁下水道中水垢和头发等污垢,具体的产品有BioGuard Plus[85]。

5.2 纺织行业

作为一种天然动物蛋白纤维,羊毛制成的衣物保暖且舒适,但由于羊毛纤维的特殊鳞片结构,难以在纺织加工中进行扎染加工,特别其内部含有高度交联的二硫键,有很强的生物抗性,因此,在应用前,需要对羊毛进行处理。

传统的化学方法处理羊毛纤维时,常使用氧化剂,这虽使鳞片变软,但毡缩性能下降,特别是该方法腐蚀性强,会伤及纤维皮质层。物理方法处理羊毛纤维主要利用等离子体处理技术,经过该方法处理后的羊毛抗纤维断裂能力得到提高,褪色效果也减弱,但此方法处理过程复杂,对处理装置要求高,因此,目前还仅仅停留在实验室阶段。还有使用可吸收有机氯化物(AOX)来加工羊毛的工艺,虽然可控制羊毛纤维的毡缩性[115],但是这种处理工艺会影响纤维的质量,同时化学物品也会对环境造成危害。另外,其他化学方法的处理过程,包括清洗、漂白或染色,也会产生有毒化学品的排放[85]。

使用蛋白酶处理羊毛纤维是一种安全环保的方式,它不仅能够降解羊毛角质层而不会对其他纤维部分造成任何损害,还能提高羊毛织物的质量,被认为是传统化学方法的最佳替代方式[116]。芽孢杆菌B.subtilisBBE11-1分泌的丝氨酸蛋白酶,经适当浓缩后与Savinase复配,能有效防止羊毛缩水,同时降低羊毛织物的质量损失[117]。另一种丝氨酸蛋白酶(约3.2×104),Lv等[118]将其基因在金黄杆菌ChryseobacteriumL99 sp. Nov中表达,结果发现：该酶反应条件温和,40 U/mL的蛋白酶可以有效防止羊毛缩水;而假单胞菌Pseudomonas3096-4分泌的粗角蛋白酶处理羊毛织物6 h后毡缩率为4.1%(低于5%),符合国际毛纺织组织(IWTO)TM31的可机洗标准。另外,解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensMA20、枯草芽孢杆菌B.subtilisMA21[120]、链霉菌属Streptomycessp. 2M21[121]、嗜麦芽窄食单胞菌StenotrophomonasmaltophiliaBBE11-1[122]和黄青霉菌株P.chrysogeniumX5[123]来源的蛋白酶都有应用于纺织行业的潜力。

此外,纺织业的废弃材料一直是环境污染的一大问题。随着生活水平的提高,人们越来越追求时尚,每年有大量服装在使用后被丢弃,回收这些衣物及其资源化利用已经成为一大挑战,蛋白酶在该领域有着较好的应用前景。因为蛋白酶可以从羊毛和聚酯混纺织物中选择性降解羊毛纤维。Navone等[124]采用Ronozyme©ProAct蛋白酶两步法降解羊毛纤维,先后添加不同剂量的蛋白酶和巯基乙酸钠还原剂对羊毛纤维进行不同时间的处理,结果发现：织物混合物中的天然纤维被完全降解,通过光谱和粒度分析回收的合成纤维,与原始样品相比,酶对聚酯处理后的性能没有显著的影响。因此,处理后的聚酯纤维可以再造成聚酯纱,用于制造新成衣或其他产品,可促进循环经济的发展。

5.3 皮革行业

在皮革行业中,皮毛的脱毛过程是一大挑战。脱毛即在不破坏皮肤和毛发结构的情况下去除皮肤上的毛发[125],包括浸泡、脱毛、软化和晒黑这4个步骤,常用的化学试剂为Na2S和CaO,这2种物质可以有效地去除皮毛,但同时会对环境造成污染,并对工作人员的健康造成危害。另外,Na2S和其他化学品一起排放到环境中,造成水污染。如果进行化学处理水污染,还会导致水体生态紊乱,使得生化需氧量(BOD)、化学需氧量(COD)、总溶解固体(TDS)和悬浮固体总量(TSS)等增加[126]。与传统的化学方法相比,利用蛋白酶处理皮革是一种经济有效的方法,因为该工艺不会释放化学毒物,所以用生物催化剂代替无机硫化物来处理皮革在保护环境和脱毛效率方面都有很大的优势[127]。

已经有商业蛋白酶用于脱毛过程的浸泡、脱毛和软化,如Aquaderm©、NUE©、Pyrase©和Clarizyme。另外,还有一些商业角蛋白酶,Koropon©SC 5K,Basozym©CS 10和Pyrase©250 MP主要用于皮革行业中的软化工艺部分[128]。Paul等[129]将伍松类芽孢杆菌PaenibacilluswoosongensiTKB2通过固态发酵的方式产蛋白酶,并使用响应面的方法优化产酶条件,将优化前后的粗蛋白酶用于脱毛,结果发现：与非优化条件下的蛋白酶相比,该蛋白酶可在14 h内将山羊皮脱毛;经过普通显微镜和电子显微镜对脱毛结果进行评估,并与常规的化学方法进行比较,用蛋白酶处理的山羊皮质量更好,不会破坏内部的胶原蛋白层,造成的污染也比较少。

Santha Kalaikumari等[130]研究发现：拟青衣芽孢杆菌BacillusparalicheniformisMKU3可高效生产蛋白酶,在72 h内的最大酶产量为1 872.5 U/mL,在大型生物反应器中只需24 h就可产生蛋白酶;将此蛋白酶用于羊皮脱毛,扫描电子显微镜分析显示,脱毛的羊皮没有毛发残留、毛孔增大;横断面分析也显示毛发连同根部被完全去除,处理过的样品区域也显得非常光滑且皮革质量良好;对脱毛后的废水进行分析,COD降低约30%、TDS和TSS分别减少了70%和96%。Zhang等[131]发现,来自副短小芽孢杆菌BrevibacillusparabrevisCGMCC 10798的丝氨酸蛋白酶的分子量为2.8×104,用该蛋白酶处理山羊皮并与化学法处理山羊皮进行比较,结果发现：经过蛋白酶处理后的皮肤呈白色、触感更柔软光滑;而通过化学方法得到的皮肤颜色较深,有皱纹且触感较硬。还有Macedo等[132]发现,枯草芽孢杆菌BacillussubtilisS14的角蛋白酶,在脱毛过程中不会损伤胶原蛋白。Prakash等[133]等发现,来自嗜盐芽孢杆菌BacillushaloduransPPKS-2的蛋白酶可有效用于去除山羊皮上的毛发。Jaouadi等[134]发现,从短杆菌BrevibacillusbrevisUS575菌株中新分离的胞外角蛋白酶(KERUS)有着强大的脱毛能力且对胶原蛋白的损伤最小。总之,角蛋白酶能作用于皮毛,打开毛孔,使毛囊松弛,从而从根部彻底去除毛发,且不会损害毛发。与化学法相比,经角蛋白酶处理后皮革的拉伸力更好,皮革的胶原结构没有损害,染色效果也有所提高[101]。可见,使用蛋白酶法脱毛比传统的化学方法更高效且环保。

5.4 饲料及食品行业

饲料的成分主要是玉米、豆粕和膨化大豆等,其中,豆粕是猪、牛等动物日粮中最广泛使用的氨基酸来源,但是豆粕中含有过敏性蛋白,如大豆球蛋白(约占40%)和β-伴大豆球蛋白(约占30%)等[135]。特别地,这些过敏性蛋白中胱氨酸的二硫键不仅会影响消化[74],而且会引起动物胃肠道黏膜损伤、腹泻和免疫功能紊乱[136]。虽然通过预处理可以提高饲料的利用率和营养价值,但成本相对较高,相比之下,酶催化方法更为经济有效[137]。在饲料中添加角蛋白酶可以提高猪的氨基酸营养消化率和回肠表观消化率[138]。因为存在于消化道内的内源性蛋白水解酶主要用于消化蛋白质,包括胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶等[139],而外源蛋白酶作为单组分产品,与各种酶混合使用已成功用于家禽饲养。最近,Hu等[140]发现,在玉米-豆粕型饲料中添加外源酸性蛋白酶可线性提高粗蛋白质的消化率,另外赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸和酪氨酸的回肠消化率也有所提高。

Cowieson等[141]研究添加外源性蛋白酶对肉鸡的生产性能、营养物质消化率和各种肠道健康指标的影响,结果发现：添加蛋白酶可提高肠道的拉伸强度、绒毛高度,更可减少上皮厚度并降低杯状细胞数量,这些形态变化均表明肠道完整性和弹性有所增强。Mahmood等[142]研究发现,在饲料中添加外源蛋白酶会提高家禽的生长性能和蛋白质消化率。Zhang等[143]研究发现,在饲料中添加外源性蛋白酶35～65日后,可以改善仔猪的肠道健康,促进营养物质消化,提高生长性能。Tactacan等[144]研究证实,在断奶仔猪中的饲料中补充蛋白酶可提高其生长速度。

常用的商业蛋白酶有Cibenza©DP100和Versazyme。如,将Versazyme添加到饲料中,可改善动物的生长性能、胸肉产量和肠绒毛结构[145],加快动物生长。另一种角蛋白酶Cibenza©DP100可用于促进仔猪生长[74]。Ronozyme©ProAct丝氨酸蛋白酶由地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis生产,Saleh等[146]发现,在饲料中添加该酶可提高仔猪的生长和饲料转化率,当添加水平为200～300 mg/kg,可能提高蛋白质的利用率,生长性能、营养物质利用、肉鸡脂质过氧化等都有改善,这可能是由于蛋白酶可以分解抗营养物质(如胰蛋白酶抑制剂),从而提高氨基酸的利用率。

蛋白酶还可应用于食品工业中,因为一些内肽酶和外肽酶可裂解蛋白水解物末端(N和C端)或肽段内部的疏水氨基酸,以此来去除食品中的苦味[147]。大豆蛋白会引起人或动物的过敏反应,这主要是由免疫球蛋白E(IgE)引起的,利用胃蛋白酶和糜蛋白酶对大豆2S蛋白进行水解,可以降低大豆蛋白的致敏性[148]。天冬氨酸蛋白酶作为奶酪中凝乳酶的替代品,在烘焙食物中可以提高谷蛋白的溶解度,还可用于啤酒和葡萄酒中雾状物及沉淀的去除等[149]。

由此可见,蛋白酶在饲料及食品领域发挥着重要作用,具有良好的应用前景。

5.5 化妆品行业

角蛋白酶可作用于人体皮肤以及其他的角质组织,在化妆品行业中具有潜在的应用价值[150]。与化学工艺相比,在化妆品中使用生物技术获得的有生理活性的化合物,具有抗氧化、抗衰老、抗皱和美白等生物特性,且无副产物[151]。如,生物活性肽有助于调节生物反应,包括改善皮肤生理机能。低分子量(<103)的角蛋白降解得到的功能短肽能够渗透到皮肤中并改善皮肤的保湿能力,增加皮肤的弹性[152]。因此,将蛋白酶添加到化妆品的配方中,不仅可以降解蛋白质释放多肽,使皮肤更加光滑细腻,而且还产生消炎、淡斑和美白等功效[153]。头发由角蛋白和少量脂质组成,阳光、高热量和日常的染发烫发、漂洗等都会给头发造成一定的损害,如将角蛋白酶添加到洗发水、护发素等洗护用品中,可以改善头发的质量,减少头发纤维断裂,增加头发光泽等[154]。

Kshetri等[155]发现,来自Bacillussp. RCM-SSR-102的角蛋白酶KER102(分子量为3.0×104)是一种碱性丝氨酸金属蛋白酶,它可将角蛋白废物转化为具有生物活性的角蛋白水解物,得到的蛋白质水解物显示出抗氧化性和抗酪氨酸酶的活性[155]。酪氨酸酶是一种使黑色素形成的限速酶,因此具有抗酪氨酸酶活性的物质有利于皮肤的美白,将其用于化妆品中,可改善皮肤的弹性并提高皮肤的保湿能力[152]。熊果苷是一种酪氨酸酶抑制剂,被广泛应用于美白化妆品中。熊果苷十一烯酸酯可以由枯草芽孢杆菌的蛋白酶(Bioprase),催化酯交换反应而合成[156],熊果苷十一烯酸酯可有效降低黑色素的产生,与对照组相比,使用0.1 mmol/L熊果苷酯孵育B16黑色素细胞6 d后,黑色素的生成水平下降到初始的30%左右[157]。使用BacillussubtilisAMR产生的角蛋白酶降解羽毛可得到多种蛋白质水解物,其中包含角蛋白肽和氨基酸,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)检测结果显示,水解物中含有分子量为(0.8～1.0)×104的多肽;通过扫描电镜分析显示,这些低分子量的多肽护发产品能够显著提高毛发纤维的亮度和柔软度[154]。

角蛋白酶还可应用于人们使用的脱毛膏产品中,如BacillussubtilisDP1生产的碱性蛋白酶,在pH 为8.0～12.0条件下保存16 h之后,依然保持90%的稳定性,用该角蛋白酶代替脱毛膏中的巯基乙酸盐来制备生物脱毛膏,与商业脱毛膏相比,脱毛效率显著提高[158],这说明将角蛋白酶添加到脱毛膏中有着广阔的前景。

5.6 医药行业

在医药行业,蛋白酶也有广泛的应用,主要用于治疗痤疮、指甲疾病以及朊病毒等方面。

5.6.1 指甲和皮肤

指甲甲床的真菌感染与指甲脱落是目前最常见的两种疾病,大多数指甲疾病难以治愈,尤其是甲床下方发生感染的疾病。目前的治疗方案包括口服抗真菌药和外敷用药,然而这些治疗方法同时也存在着副作用(如疼痛、肝损伤等),同时还存在药物之间的相互作用对人体造成的危害[159]。因此,开发了在局部应用某种药物的替代疗法,但是此方法因药物在整个甲床上的渗透性差,导致疗效有限[160]。角蛋白酶可以结合还原剂二硫苏糖醇,提高对指甲的渗透性从而使药物顺利进入指甲内部[161],在一定程度上通过损害甲板的完整性以增加药物的渗透性。目前,用于对指甲疾病治疗的商业产品包括Fixa Fungus TM、Kernail-soft PB和Pure100 Keratinase[17]。

Tiwary等[162]将从地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisER-15中获得的角蛋白酶与一种新型单体γ-谷氨酰转肽酶(GGT30)的复合物(命名为KerN),作用于指甲,结果发现：KerN能够使甲基质松弛,腐蚀甲背表面,进而使药物渗透进指甲内部,用于治疗甲癣。Gupta等[163]将来自枯草杆菌B.subtilisRSE163的角蛋白酶与银屑病外用的局部药物结合,用于增强药物的吸收和渗透[163]。除了用于指甲疾病外,蛋白酶还可应用于皮肤组织中,作为皮肤的渗透剂以增强药物透过皮肤表面,向里层传递。

5.6.2 痤疮

痤疮在青少年中是一种常见的皮肤疾病,主要是分泌过多的角蛋白导致皮脂堵塞。一些角蛋白酶可以溶解死细胞和堵塞皮脂腺的角蛋白,因此可用于治疗痤疮[85]。如,一些商业角蛋白酶的产品Keratopeel PB 和Keratoclean Sensitive PB可用于痤疮治疗。来自地衣芽孢杆菌B.licheniformisPWD和大肠杆菌E.coli的角蛋白酶已用于痤疮的治疗[161]。另外,金属蛋白酶对于治疗痤疮也有重要的作用[164]。

5.6.3 朊病毒的治疗

朊病毒是引起神经退行性疾病的传染因子,这些疾病具有传染性和致命性,如传染性海绵状脑病(TSE)会影响许多哺乳动物[165]。朊病毒一般是由正常的蛋白质变性所导致的。目前朊病毒的传播方式主要包括人类食用受污染的肉类,屠宰场、医院的污水以及被污染的医疗器械引起的医源性传播。当前朊病毒的净化方法主要是使用高温、极端pH以及刺激性化学品[160]。然而这些方法不仅对环境有危害,而且容易损伤医疗器械,使得科学家们开始转向角蛋白酶治疗朊病毒的应用研究。

Okoroma等[166]将来自地衣芽孢杆菌B.licheniformisN22的角蛋白酶与铜绿假单胞菌P.aeruginosaNCIMB 8626的生物表面活性剂一起作用于被朊病毒(PrPSc)感染的离体细胞,在65 ℃下孵化10 min后,该酶将瘙痒型朊病毒降解至无法检测到的PrPSc信号水平;同时发现,角蛋白酶的催化机制和生物表面活性剂的溶解特性起到了重要作用。该方法可用于净化医疗器械中的朊病毒。

从Bacillus分离的MSK103丝氨酸蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶,最适pH为9.0～10.0、最适温度为60～70 ℃,Yoshioka等[167]将该蛋白酶用于被朊病毒感染的小鼠、仓鼠和牛的脑匀浆,微孔板去污结果表明,它能够有效降解被PrPSc感染后的脑匀浆且无须洗涤剂和热的预处理。该蛋白酶也可用于易受PrPSc污染的精密仪器的净化。

除了上述的蛋白酶外,Sharma等[168]发现,γ-谷氨酰转移酶-谷胱甘肽(GGT-GSH)和角蛋白酶rKP2的协同作用可有效降解替代朊病毒蛋白Sup 35NM,因此,这种组合未来也可用于降解朊病毒。Mitsuiki等[169]从诺卡氏菌属Nocardiopsissp. TOA-1分离得到碱性蛋白酶NAPase,将该酶用于被感染的仓鼠,结果发现：在pH 11.0和60 ℃条件下,4 μg的NAPase在3 min可将瘙痒的朊病毒蛋白完全降解。

5.6.4 其他

不同配方的无纺布组织和一些含有由枯草芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶的软膏在皮肤病方面也有很好的治疗效果[170]。

5.7 生物能源

角蛋白酶也可用于生物能源领域。角蛋白酶水解羽毛产生的氮,不仅可以促进土壤微生物生长、改善植物生长、增加土壤的保水能力[171],而且可以通过对角蛋白废物的厌氧消化生产沼气用作燃料。理论上,挥发性固体中的蛋白质的甲烷产量可以达到0.496 m3/kg,但实际上废羽毛产生的甲烷产量只有0.21 m3/kg[172]。目前,可通过角蛋白酶处理挥发性固体以提高甲烷产量,Salminen等[173]使用来自转基因枯草芽孢杆菌的商用碱性内肽酶Multifect P-3000©结合热处理,对羽毛进行预处理,使甲烷产率提高了37%～51%。Mahdy等[174]利用丹麦Novozymes公司的蛋白酶Alcalase 2.5L和Viscozyme对小球藻预处理来产生沼气,得到较高的甲烷产量(每克COD产137 mL CH4)。Patinvoh等[175]利用芽孢杆菌C4产生的角蛋白酶对鸡毛进行预处理,与未处理的羽毛相比,在厌氧消化55 d后,相对于使用污泥和细菌作为接种物,产量分别提高237%和124%[175]。Mahdy等[176]通过添加蛋白酶Alcalase对小球藻进行水解,结果发现：厌氧生物降解率达到86%,且沼气的产量提升了一倍。虽然角蛋白酶在能源行业具有极高的应用潜力,但是目前相关蛋白处理技术仍不成熟,所以基于角蛋白酶生产的沼气仍需进一步研究。

6 总结与展望

蛋白酶由于其特性,越来越受到人们的关注。不同特性的蛋白酶在不同的行业发挥着巨大的作用,一些以蛋白酶为基础的产品已经商业化,但是目前有关蛋白酶的研究成果仍然有限,尤其是在催化转化的机制方面,还需要学者进一步的探究。

此外,我国大部分蛋白酶都依赖进口,且蛋白酶序列被国外高度垄断,特别是我国目前缺乏低温碱性蛋白酶、在工业上具有稳定性的蛋白酶和抗自切的蛋白酶。因此,可通过改造、重组、修饰等方式来改善蛋白酶的结构和功能。目前,通过基因修饰和蛋白质工程来提高蛋白酶产量的方法已经被广泛使用,利用生物信息学的工具有助于进一步改善蛋白酶性能。在日益扩大的工业中,利用蛋白酶也是一种环境友好的方式,随着对蛋白酶的不断研究和探索,未来蛋白酶会有更广阔的发展空间和良好的应用前景。

随着人民生活水平的提高,高端蛋白酶产品在人们日常生活中显得十分重要,这更需要加大科研的投入,创制有自主知识产权的蛋白酶,以国家战略及市场需求为导向,基于生物酶研发的先进酶挖掘、高效进化和(半)理性设计技术,从序列源头挖掘、筛选和设计具有自主知识产权的新基因序列,利用自主构建的生产菌株,建立高强度生产技术并获得新产品,实现“基础研究—技术创新—工业应用”的全链条设计和新型蛋白酶产品的开发。