质谱技术在呼吸气体检测中的进展与应用前景

吴瑛华，李 静，潘振华，孙美秀，李迎新，2

对呼出气体进行分析自古有之。中医中有通过识别患者气味变化来进行诊断的方法，古希腊医生也认为呼气中的一些特征气味与某些疾病存在联系[1]。 不过这些方法都只停留在经验上，古代医学做不到对患者呼出气体气味的变化做出合理解释。

近年来， 呼气检测作为一种非侵入性的检测方法，能够在几乎对人体无伤害无负担的情况下了解人体新陈代谢和疾病状况[2]。 人体相当一部分的新陈代谢产物都会在血液的运输作用下到达肺部，最后由呼出气体排出体外。目前能够在人呼出气体中检测到的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）高达1 000 余种，已鉴别的能够指示疾病和代谢异常的常见VOCs 也有30 多种， 多为戊烷为代表的一类烷烃、异戊二烯和丙酮等。目前，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）已经批准了一些用于临床诊断的呼气标志物，包括幽门螺杆菌感染的13C， 用于哮喘诊断的一氧化氮 （nitrogen monoxide，NO）等。分析呼出气体的成分对许多疾病的诊断都有着非常重大的意义。

当前呼吸分析的目标主要是以下几个方面：①识别和量化呼出气体中的挥发性微量化合物；②识别呼出气体中常见代谢物的异常浓度；③区分内源性和外源性化合物；④确定与特定疾病状况相关的新生物标记化合物；⑤跟踪呼吸代谢物浓度在短时间和长时间内的变化，以支持药代动力学、纵向研究和治疗效果的监控[3]。

呼吸分析常见的几种方法中，目前最常用的检测呼吸中VOCs 的方法多为色谱法， 其局限性在于：需要对采集的样品进行较为复杂的前处理和分离检测等步骤、难以做到实时分析、样品制备技术和分析条件存在巨大差异而导致的标志物列表及分析结果的差异、重现性受到色谱系统灵敏度限制等。 随着新兴技术的发展，高灵敏度和高反应速率的质谱仪器进入了人们的视野，它无需复杂的前处理，且能做到实时分析，因此质谱检测成为呼气检测的更好选择。

文章重点介绍直接质谱技术在呼吸分析中的应用进展及前景。

1 已建立的呼吸标志物与人体疾病和代谢异常的关系

呼出气体的主要成分是水蒸气和二氧化碳，除此之外，还有着非常复杂的气体组分，其中作为目前研究重点的挥发性有机物部分仅占呼出气体总体积的不到1%。 人的呼出气体大致分为三个部分，即气体部分、挥发性部分和呼吸冷凝物，目前大多数的呼吸测试针对后两个部分。

何为生物标志物？ 美国国家卫生研究院（National Institutes of Health，NIH） 使用的一个广泛接受的定义是：“一种被客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或对干预的药理学反应的指标。”截止到目前的研究表明， 人体呼出气体中存在着1 000 种以上的化合物，其浓度大小不等，每个人的呼出气体成分都存在差异，目前呼出气体中已经确定的能够指示疾病和代谢异常的化合物大约有35 种[4]。表1 列出了一些常见的呼吸标志物与其指示的疾病或代谢异常[5~8]。

表1 常见生物标志物及与其相关的疾病或代谢异常Tab. 1 Common biomarkers and related diseases or metabolic abnormalities

实际上在很多情况下，一种化合物不只能够指示一种疾病或者代谢异常，比如丙酮浓度异常能同时指示肺癌、糖尿病、脑癫痫等疾病；一氧化碳浓度异常能指示氧化应激、呼吸道感染和贫血等等，表2 列出了一些感染性疾病及其相关的呼吸标志物。同一种疾病出现时也不只会造成仅仅一种呼吸成分的浓度变化，比如肺癌一种疾病，就可以用丙酮、乙醛、丁烷等多种化合物来进行诊断[9，10]。

表2 感染性疾病及其相关的呼吸标志物Tab.2 Infectious diseases and related respiratory markers

事实上，临床中已经建立起了相当一部分挥发性有机物与相关疾病及代谢异常对应的呼吸气体检测流程和方案。目前已经大量运用于临床的呼气检测项目有呼吸功能检测（检测二氧化碳）、13C-尿素呼气实验（检测同位素标记后的二氧化碳）、 新生儿黄疸（检测一氧化碳）、双糖不耐受及小肠菌过度生长（检测氢气和甲烷）、哮喘检测（检测一氧化碳）、心脏抑制排斥（检测烷烃）、胃排空监测（检测同位素标记后的二氧化碳）、吸烟监测（检测一氧化碳）、醉酒监测（检测乙醇）等。 就目前的应用现状来看，早期肿瘤监测和感染性疾病的筛查是呼气检测的未来主要发展方向[11]。

许多呼吸标志物与疾病的关系到目前为止依然不明确，其详细的形成机制也有待进一步的研究和证明[12]。 因此，为了满足客观测量的要求，呼吸研究中最重要、也是最具挑战性的方面是开发分析方法，能够检测、积极识别和准确定量适当低水平的内源性痕量化合物， 使其更多地作为生物标志物应用于临床，迫切需要通过呼气分析这种可靠和精确测量化合物浓度的形式发现生物标志物，而飞速发展的质谱技术正好为实现这一目标提供了可靠的途径。

2 直接质谱技术

质谱技术是一种鉴定技术，在有机分子的鉴定方面发挥非常重要的作用。它能快速且极为准确地测定生物大分子的相对分子质量，使蛋白质组研究从蛋白质鉴定深入到高级结构研究及各种蛋白质之间的相互作用研究。质谱法的优点是特异性好、灵敏度高、速度快等，因此在呼吸气体的分析方面应用比较广泛[13]。

根据是否能够实时分析气体，直接质谱技术又分为非实时在线分析和实时在线分析两种[14]。

非实时在线分析的质谱技术主要有离子迁移质谱（ion mobility spectroscopy，IMS）、电喷雾萃取电离质谱 （extractive electrospray ionization-mobility spectroscopy，EESI-MS）等。 离线采样的优点在于不受采样位置的限制，但是目前的方法对样品的运输、储存和分析的前处理都提出了很严格的要求，因此又产生了一些实时在线分析的方法。实时在线分析质谱技术主要有质子转移反应质谱（proton transfer reaction-mass spectrometry，PTR-MS） 和选择离子流动管质谱（selective ion flow tube-mass spectrometry，SIFT-MS）[15]。

实时取样和分析有利于减少样品在收集、储存和处理过程中发生降解和其他变化，有些生理变化可能发生在几分钟甚至几秒钟内（比如锻炼）， 传统的采集—运输—分析的方法会给分析过程引入更多的误差[16]。 另外快速表征呼出气体的动态变化对于药物动力学和毒理动力学评估也非常重要，因为在此类研究中，外源化合物的吸收、分布、代谢和排泄在非常短的时间尺度上进行，其浓度变化很难被离线采样的经典分析方法捕捉到[17，18]。因此，实时分析是分析快速生化过程的最优方案。

3 直接质谱技术在呼吸分析中的研究进展

随着直接质谱技术的飞速发展和人们对无创早诊技术的追求，直接质谱技术越来越多地被运用于呼吸分析。

一些早期研究为质谱技术在呼吸分析中的广泛运用奠定了基础：比如Gaida A 等[19]使用了将GC 技术与IMS 技术串联的方法， 实现了分析前的样品预分离， 将该技术运用于慢性肺阻塞患者的呼气检测，从而筛查出了3 种VOCs 作为该种疾病的标志性有机物。 2007年，Chen H 等[20]首次采用了EESI-MS 的方法对人体呼出气体进行了质谱研究，最终建立了一项快速指纹谱图分析法，并应用此方法分别对亚洲和欧洲志愿者的呼出气体进行分析，旨在研究呼出气体指纹图谱是否与生活的地域有关，Chen H 等的研究为EESI 在活体分析中更深层次的应用奠定了基础。SIFT-MS 最初是为了在环境研究中直接量化微量蒸汽和气体而开发的；而如今，它的用途已扩展到许多其他应用，如医学研究、食品科学和考古学，近年来在呼吸分析方面发展尤为迅速。 系统的文献检索表明，使用SIFT-MS 进行呼吸分析的已发表同行评审文章中，已经超过了十分之一（11.2%）。PTR-MS 于20 世纪90年代中期由Majchrzak T 等[21]首次推出，并在过去几十年中取得了巨大的发展。PTR-MS 的一些最早用途是Beauchamp J 等[22]将其用于呼气分析以诊断疾病等。

近年来，直接质谱技术有了更加先进的结合方式和分析方式，国内外的学者均做了大量研究。

LI X 等[23]通过使用次级纳米电离喷雾耦合高分辨率质谱（secondary nanoionization spray coupled high resolution-mass spectrometry，Sec-nanoESI-HRMS）实时表征呼出气体中的VOCs，一次测量分析仅需要30 s；Zou X 等[24]采用直接呼吸采样系统和PTR-MS 相结合的方式在线检测呼吸丙酮以探究运动和饮食在减肥中的影响；Chin ST 等[25]研究了多个MS 平台，发现多平台策略能够更好地发现食管癌患者呼气中VOCs的分布；Segers K 等[4]用SIFT-MS 分别分析了哮喘及囊性纤维化儿童的呼出气体， 得到了较好的分辨能力；Hong Y 等[26]运用单光子电离质谱（single photon ionization-mass spectrometry，SPI-MS） 针对胃癌患者的呼出气体建立了预测精度较高的模型；Weber R等[27]用二次电喷雾电离高分辨率质谱（secondary electrospray ionization high resolution-mass spectrometry，SESI-HRMS） 检测了囊性纤维化儿童呼气中的VOCs 特征， 并建立了有一定能力的预测模型；Zhou W 等[28]运用PTR-MS 研究了宫颈癌患者的呼出气体，最终筛查出了4 种关键特征用于鉴别宫颈癌；Slingers G 等[29]将热脱附法（thermal desorption，TD）与SIFT-MS 相结合，通过对健康人呼气样本的分析证明SIFT-MS 与TD 结合后分析能力得到了提升；Gaugg MT 等[30]运用SESI-HRMS 分析了慢性非阻塞性肺疾病患者的呼气，证明SESI-HRMS 能够为患者提供持续生化过程的监测；Thevis M 等[31]运用液相色谱串联质谱分析运动员的呼气样本，证明该种策略能够对现在的兴奋剂检测提供补充方案；Welearegay TG 等[32]用专门开发的电子鼻系统对囊性包虫病患者的呼气进行分析， 提供了一种对包虫病的新的无创诊断方法；葛殿龙[33]用固相微萃取气相色谱质谱（solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）对食管癌患者的呼气进行了研究，确定了Z-1-甲硫基1-丙烯为一种可能的标志物。

随着现代计算机技术的发展，在对呼气检测的研究中，质谱技术也开始与人工智能的方法相结合。

Adam ME 等[34]用以Xgboost 为基础构建的算法对采集到的的肺癌患者及健康人呼气样本进行分析，区分准确度达到87.63%。 Bade BC 等[35]联合影像和呼气样本进行标志提取和建模，肺癌患者和良性肿瘤患者的区分准确度达到了97.87%。Chin ST 等[25]多平台策略能够较精准地发现食管癌患者呼气中VOCs的分布；Segers K 等[4]哮喘及囊性纤维化儿童的呼出气体模型判断准确度达到了89.74%；Hong Y 等[26]胃癌患者的呼出气体模型预测精度达90.17 %；Weber R 等[27]囊性纤维化儿童呼气预测模型精度达到85%以上；吴思[36]用包括人工神经网络（artificial neural network，ANN）在内的4 种模型对胃癌患者的呼气进行了建模分析， 最终确认了10 种具有差异性的特征成分。

由此可见，不断改进的直接质谱仪器凭借更高的反应速率、更低的测量极限、更多的同时测量组分为呼气检测提供了强有力的硬件支持。 同时，以人工智能为代表的各种其他技术，如影像技术、血液检测技术等先进技术更多地与质谱技术结合，质谱技术将更广泛地应用于呼气检测领域。

4 质谱呼气检测临床应用挑战及前景

随着临床检测越发趋于个体化和精准化发展，更快速更准确地得到检测结果成为了临床诊断一个重要的需求，近年来呼吸气体检测质谱技术的临床应用成果初显，成为了临床诊断中前景斐然的一项检测方法。 然而质谱呼吸检测也存在着许多有待解决的问题，主要存在于以下几个方面：

（1） 目前专业用于气体分析的质谱仪器昂贵、笨重，需要专业人员进行操作、数据分析和解释，因此只能在医院和较大的诊所提供，这就阻碍了这些仪器用于日常生活中的呼吸气体分析，而呼气分析的一项重要目标就是通过健康监测实现疾病的早期诊断，因此其一大发展目标就是使呼气检测的仪器成本更低、操作更简单，方便进入千家万户[37]。

（2）呼出气体的采集和选取存在困难。首先，并不是所有的质谱分析技术都能直接分析呼出的气体，而收集到的呼出气体会随着放置时间的增加逐渐降解，因此呼气的收集和储存也是一个重大问题。 其次，到底是使用鼻子呼出的气体还是口呼出的气体进行分析，在研究界依然存在争议。再次，不同患者的吹气流速和浓度等的不同，给呼气分析的标准化带来了更多更复杂的挑战。最后，很多呼气成分是外源性的，有些甚至不是系统产生的，成为另一个混淆因素。

（3）目前用于呼气检测的质谱仪中传感器仅限于少数几种疾病，如糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等，这些疾病的共同特点是可以用单一的生物标志物来进行检测，然而在大多数疾病中，尤其是不同的癌症中，随着病情的发生发展，多种呼出气体的浓度会同时发生变化，很难用一种特定的传感器来处理，使得分辨健康人群和疾病人群变得更加困难[38]。

此外还有实验室标准化不足、缺乏合适的待测物标记、样品制备过程自动化程度不足、许多步骤仍需要人工核对、专业人员短缺、前期设备开发费用高昂等。

因此，质谱呼气检测的未来应该着重于解决以下问题：建立更多新的生物标志物系统；建立疾病和呼出的呼吸生物标志物浓度之间的标准相关性，建立标准的呼吸收集和存储程序；区分呼出气体中的外源性和内源性气体；开发用于选择性检测呼吸气体的新型特异性纳米材料；开发操作简单、可重复、可靠、实时、质量轻、价格低廉的手持设备；进行大量适当的临床试验，包括尽可能多的受试者和实验验证等。

综上所述，质谱呼气检测是一个跨学科的研究领域，涵盖了医学、数据分析、材料化学、数据处理、医学电子等多个方面，这是一个快速发展的领域，即将通过逐步实现疾病的早期诊断而对社会做出巨大贡献。目前商用的呼气检测质谱仪依然是GC-MS 居多，随着直接质谱技术的继续发展，呼气检测仪器将更多采用更新型的质谱技术，实现更加方便、快捷、实时的呼吸气体检测。 随着各方面的研究进展，在疾病的筛查上会逐步形成共识，低成本、操作便捷的非侵入式呼气检测质谱仪正处于产业爆发的前夕[39]。