超高效液相色谱-串联质谱法同时测定藤黄药材中5种成分的含量

王超 郭春梅 程红新 史延通

【摘要】目的：采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法建立同时测定藤黄药材中藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸5种成分的含量。方法：藤黄药材经75%乙醇水超声提取，以ZORBAX Eclipse Plus C18为色谱柱、0.1%甲酸水-乙腈（30∶70，V/V）为流动相，流速为0.4 mL/min，柱温为35℃；质谱采用电喷雾离子（ESI）源、正离子扫描的多反应监测（MRM）模式进行定量分析。结果：藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸分别在51.00～1020、3.749～74.98、8.675～ 173.5、60.00～1200、47.95～959 ng/mL（r均大于0.9990）的浓度范围内呈现良好的线性关系。5种成分的平均加样回收率分别为97.2%、98.1%、97.9%、97.0%、99.3%，RSD分别为2.1%、2.1%、2.3%、1.9%、2.1%。藤黄药材中上述5种成分含量分别为22.98%～ 23.63%、1.28%～1.35%、2.78%～2.89%、26.13%～26.54%、22.29%～22.40%。结论：该方法操作简便、准确、可靠，可用于藤黄药材的多指标成分定量测定。

【关键词】超高效液相色谱-串联质谱法；藤黄；含量测定

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.033

Simultaneous Determination of Contents of 5 Components in Gamboge by UPLC-MS/MS

WANG Chao，GUO Chunmei，CHENG Hongxin，SHI Yantong

（Liaoning Institute for Drug Control，Liaoning Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS / MS）method for the simultaneous determination of Gambogic acid，Gambogellic acid，Morellic acid，Isogambogic acid and Gambogenic acid in Gamboge. Methods：Gamboge was extracted by ultrasonic extraction with 75% ethanol-water. The determination was performed on ZORBAX Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of 0.1 % formic acid solution-acetonitrile（30∶70，V/V）at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 35℃. For quantitation，the electrospray ionization（ESI）source was applied to carry out the positive ion scanning with multiple reaction monitoring（MRM）mode. Results：The linear range of Gambogic acid，Gambogellic acid，Morellic acid，Isogambogic acid and Gambogenic acid were 51.00～1020、3.749～74.98、8.675～173.5、60.00～1200、47.95～959 ng/ mL（all r≥0.9990）respectively，which showed a good linear relationship within the concentration range. The average recoveries were 97.2 %，98.1 %，97.9 %，97.0 %，99.3 %，and RSDs were 2.1%，2.1%，2.3%，1.9%，2.1%，respectively. The content of the above five components were 22.98%～23.63%、1.28%～1.35%、2.78%～2.89%、26.13%～26.54%、22.29%～22.40%，respectively. Conclusion：The method issimple，accurate and reliable，which could be used as the quantitative determination of multiple index components of Gamboge.

Key words：UPLC-MS/MS；gamboge；content determination

藤黃为藤黄科藤黄属植物藤黄Garcinia hanburyi Hook. f.的树脂[1]，最早出自《海药本草》，现收录于《中药大辞典》[2]。药理学研究表明，藤黄具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[3-7]，藤黄酸和新藤黄酸等成分是藤黄的主要成分[8-9]。目前，关于藤黄含量测定的研究文献报道较少[10-11]，因此有必要建立一种藤黄中多组分的同时含量测定方法。

UPLC-MS/MS（超高效液相色谱-串联质谱）法是以超高效液相作为分离系统、质谱作为检测系统的分析技术，该分析技术将超高效液相高分离度的优势与质谱高灵敏度的特性相结合，具备分离能力强，分析时间短，灵敏度高，专属性强等优点，广泛应用于中药材的定性定量分析。本研究基于UPLCMS/MS技术建立了同时测定藤黄中藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸5种成分含量的方法，以期为藤黄药材质量控制及应用提供参考依据。

1材料与方法

1.1仪器

超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱联用仪（Xevo TQ，美国Waters公司）；电子天平（XP26，瑞士METTLER TOLEDO公司）；超纯水仪（Milli-Q Advantage A10，美国Millipore公司）；超声清洗器（AS3120A，天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2材料

藤黄酸（批号111966-201401）来自中国食品药品检定研究院；转位藤黄酸（批号10594）来自上海诗丹德标准技术服务有限公司；藤黄酸B（批号J15 GB 150695）来自上海源叶生物科技有限公司；异藤黄酸（批号CFS202001）、新藤黄酸（批号CFS202002）来自武汉天植生物技术有限公司；藤黄对照药材（编号S-01～S-05，批号121215-200602）来自中国食品药品检定研究院；色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、色谱纯乙醇（德国Merck公司）；质谱级甲酸（美国Sigma公司）。

1.3方法

1.3.1色谱条件

色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1×100 mm 1.8-Micron）；流动相为0.1%甲酸水-乙腈（30∶70，V/V）；流速为0.4 mL/min；柱温为35℃；进样量为2μL。

1.3.2质谱条件

离子源为电喷雾离子（ESI）源，正离子扫描，多反应监测（MRM）模式；毛细管电压为3.0 kV；脱溶剂温度为550℃；锥孔气流速为50 L/Hr；脱溶剂气流速为850 L/Hr；碰撞气流速为0.15 mL/min；碰撞气为氩气；其他参数见表1。

1.3.3对照品储备液的制备

精密称取藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声溶解后，加甲醇定容，配制成質量浓度分别为藤黄酸510.0μg/ mL、转位藤黄酸499.9μg/mL、藤黄酸B 399.9μg/mL、异藤黄酸479.4μg/mL、新藤黄酸433.7μg/mL的对照品储备液。精密吸取上述各单一对照品储备液适量，加甲醇配制为上述成分质量浓度依次为10.20、0.7498、12.00、0.959、1.735μg/mL的混合对照品储备液。

1.3.4供试品溶液的制备

取藤黄药材约5 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加75%乙醇水80 mL，浸泡5 min，超声处理10 min，放冷至室温，用75%乙醇水定容，摇匀，经0.22μm滤膜过滤，取续滤液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2结果与分析

2.1色谱-质谱条件的优化

通过全扫描模式确定母离子并对锥孔电压进行优化，通过不断增加碰撞能量确定合适的子离子，最终确定5种成分各自的定量、定性离子对。由于待测成分复杂且成分中具有极性相近的同分异构体，因此比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸溶液、乙腈-乙酸铵溶液等多种流动相系统，结果发现，在流动相中加入适量的甲酸可以使同分异构体达到基线分离，因此选择乙腈-甲酸溶液作为流动相。各化合物在正、负离子模式下均有响应，但当流动相系统中加入甲酸后，负离子模式响应明显降低，因此选择在正离子模式下进行检测。

2.2样品前处理条件的选择

考察了甲醇、乙醇、乙腈三种不同提取溶剂及25%、50%、75%、100%四种不同溶剂质量分数藤黄中各成分含量的影响，结果显示，不同提取溶剂对提取效率的影响不大，当以75%乙醇作为提取溶剂时提取效果相对较好，因此选择75%乙醇作为提取溶剂。比较直接超声处理和浸泡后超声处理两种不同超声提取方法，结果显示，在相同提取时间下，浸泡后超声提取液的含量高于直接超声提取液，最终选用浸泡后超声提取法。比较浸泡5、10、15 min和超声10、15、20、30 min的结果，发现延长浸泡时间和提取时间对各成分的含量无显著影响，最终选择浸泡5 min后超声提取10 min。

2.3方法学考察

2.3.1专属性

分别取空白溶剂、混合对照品溶液和供试品溶液适量，按照上述条件进样测定，色谱图见图1。由图1可知，待测成分的分离良好，空白无杂质峰干扰，表明本方法专属性较强。

2.3.2线性关系

分别精密吸取混合对照品储备液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成系列质量浓度的对照品溶液，按照上述条件进样测定，以各成分的质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，得各组分的回归方程和线性范围，结果见表2，表明藤黄中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。

2.3.3精密度试验

取混合对照品溶液，按照上述条件连续进样测定6次，计算5种成分峰面积的RSD值，结果显示，藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸的RSD分别为1.7%、1.8%、2.2%、1.8%、2.6%，表明仪器精密度良好。

2.3.4重复性试验

称取藤黃药材粉末约5 mg，精密称定，平行称取6份，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸的含量分别为23.31%、1.28%、2.88%、26.18%、22.08%，RSD分别为1.8%、2.8%、2.9%、1.8%、1.9%，表明方法重复性良好。

2.3.5定性试验

称取藤黄药材粉末约5 mg，按上述操作制备供试品溶液，放置在4℃恒温进样器中，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果显示藤黄酸、转位藤黄酸、藤黄酸B、异藤黄酸、新藤黄酸峰面积的RSD分别为1.9%、2.9%、2.8%、2.0%、3.0%，表明供试品溶液在4℃恒温进样器中放置24 h内稳定。

2.3.6加样回收试验

取同一藤黄药材约2.5 mg，精密称定，平行称取9份，分别精密加入混合对照品溶液，使加入各成分含量分别为供试品中相应成分含量的50%、100%、150%，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果见表3，藤黄中5种成分的平均回收率为95.1%～101.6%，表明该方法准确度良好。

2.4样品含量测定

精密称取编号为S-01～S-04的藤黄药材粉末约0.5 mg，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，采用外标法计算样品中各成分的含量，结果见表4。

3结论

本研究建立了一种同时测定藤黄药材中5种成分含量的UPLC-MS/MS方法。该法快速、简便、准确度高，可为藤黄药材质量控制及应用提供参考依据可为藤黄药材的质量控制提供依据。

【参考文献】

[1]郑赵情，张莉，沈凯凯，等.藤黄的研究进展[J].世界中医药，2016，11（7）：1180-1188.

[2]南京中医药大学.中药大辞典（下册）[M].第2版.上海：上海科学技术出版社，2006.

[3]张莉，蔡双璠，孔思远，等.中国藤黄属植物的药理作用研究进展[J].世界中医药，2016，1（7）：1189-1194.

[4]战鹤，韩璐，何忠梅，等.藤黄有效成分的纳米囊制备及其抗糖尿病活性评价[J].中国药房，2022，33（9）：1075-1081.

[5]HATAMI E，JAGGI M，CHAUHAN S C，et al. Gambogic acid： a shining natural compound to nanomedicine for cancer therapeutics[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Reviews on Cancer，2020，1874（1）：188381.

[6]Liu Y，Chen Y，Lin L，et al. Gambogic Acid as a Candidate for Cancer Therapy：A Review[J]. International Journal of Nanomedicine，2020，Volume 15：10385-10399.

[7]李丽梅，周俊，娄洁，等.大苞藤黄中的一个新黄酮及其抗烟草花叶病毒活性[J].中国中药杂志，2015，21（4）：4205-4207.

[8]周安，李庆林，彭代银，等.高效液相色谱-质谱联用法鉴定中药藤黄中桥环类化合物[J].药学学报，2008（8）：838-842.

[9]杨虹，丛晓东，王峥涛.药用藤黄化学成分的研究[J].中国药学杂志，2008，43（12）：900-902.

[10]赵梦中，成志平，马静，等.HPLC法测定藤黄药材中藤黄酸的含量[J].中国民族医药杂志，2020，26（1）：32-34.

[11]林青华，林宏英，魏雅蕾，等.高效液相色谱法测定藤黄药材中藤黄酸与新藤黄酸的含量[J].现代中药研究与实践，2014，28（6）：25-28.

【作者简介】

王超，女，1985年出生，副主任药师，研究方向为药品非法添加及化妆品理化检验。

郭春梅，女，1966年出生，高级工程师，研究方向为食品、化妆品检验。

程红新，女，1966年出生，高级工程师，研究方向为食品、化妆品检验。

史延通，男，1975年出生，正高级研究员，研究方向为化妆品业务管理。

（编辑：侯睿琪）