鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗冻干工艺研究

刘思桐，何平有*，邱贞娜，刘青涛，张小飞，吴雅清，郁宏伟，刘 浩

（1.瑞普保定生物药业有限公司，河北保定 071000；2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京 210014）

目前国内大多数兽用活疫苗产品的冻干保护剂主要成分为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等，保护剂配制简便，温度对抗原影响较大，在疫苗生产运输过程中难以持续保证达到疫苗所需冷链保存温度，导致温度升高，造成疫苗效力降低。应用耐热保护剂可降低活疫苗保存条件要求，从-15℃以下冷冻保存提升至2～8℃冷藏保存，国内传统的兽用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和远途运输受到限制[1-3]。

冻干活疫苗生产中抗原含量、耐热保护剂配制、冻干曲线设计是冻干活疫苗成功的关键因素。现有鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗37℃保存10d 抗原损失在0.5 个滴度以上，耐热试验抗原损失较大[4]，不利于疫苗的长期保存与运输。现有冻干工艺冻干时长45h，冻干能耗较大。为降低抗原损失及能耗，本次试验采用正交试验方法，设计6 组耐热保护剂配方，筛选出对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗病抗原保护效果最佳的耐热保护剂配方，并对冻干曲线进行进一步优化，获得理想的冻干曲线，提高疫苗生产效率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 制苗用毒液

鸡新城疫La Sota 株鸡胚液、鸡传染性支气管炎病毒H120 株鸡胚液，均由瑞普（保定）生物药业有限公司按照《兽用生物制品规程》 制备。

1.1.2 无特定病原鸡胚

无特定病原种蛋购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。无特定病原鸡胚由无特定病原种蛋自行孵化至适用日龄备用。

1.1.3 主要试剂

明胶、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮购自SIGMA；山梨醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、蔗糖均购自北京益利；水解乳蛋白，购自海克隆；海藻糖，购自南宁中诺生物科技有限公司；硫脲、半胱氨酸和维生素C 等购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器

东富龙冷冻真空干燥机，苏净安泰超净工作台，孵化器，漩涡振荡器等。

1.2 方法

1.2.1 耐热保护剂

（1）耐热保护剂配制

参照文献[5～7]，自行设计筛选出冻干保护效果较好的物质，如蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨醇等，将上述几种物质通过正交设计结果进行耐热保护剂的组方。

组分A：明胶、磷酸二氢钾、山梨醇等耐热基质按照配比去离子水溶解后高压灭菌，共配制2 个组方。组分B：海藻糖、水解乳蛋白、维生素C 等适量去离子水溶解后过滤除菌，共配制3个组方。A、B 组方用前两两组合，共配制6 组配方，标记为TR1～TR6。

（2）疫苗配制

将6 个组方分别与病毒混合液（新城疫La Sota 株∶传染性支气管炎H120 株=1∶0.4）按1∶1.4 比例混合均匀，定量分装，真空冷冻干燥，制成疫苗，分别标记为H1～H6。

（3）疫苗评价

按 《中华人民共和国兽药典（2020 版）》 三部质量标准[8]进行疫苗性状检查和病毒含量测定（包括冻干前、冻干后）。耐老化试验：取上述冻干疫苗3 瓶/ 样品，置37℃放置10d，溶解后混合均匀进行病毒含量测定。

1.2.2 冻干曲线优化

（1）耐热保护剂冻干参数测定

将筛选出的耐热冻干保护剂与毒液按照1∶1.4 比例混合，测定混合液的共晶点和塌陷温度。

共晶点检测：将混合液以10℃/min 的速率由-50℃升温至30℃，根据电阻和温度曲线确定半成品疫苗的共晶点。

塌陷温度检测：混合液-55℃冻实后，真空度20Pa，以2℃/min 升温。塌陷温度为干燥、冷冻界面出现亮度变化时的温度[9]。

（2）冻干曲线优化

应用优选保护剂TR4 配制疫苗开展冻干试验，参照保护剂TR4 配制的半成品疫苗的共晶点和塌陷温度，设计3 条冻干曲线，分别从预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段进行冻干效果研究。并按照前述方法进行疫苗性状检查、病毒含量测定（包括冻干前、冻干后）和耐老化试验测定。

冻干曲线1：疫苗常温入箱，开启冻干机进入预冻阶段，制品温度到达-30℃保温2h 确保制品全部冻实。2h 后抽真空升温进入一次干燥阶段，20h 升温至-10℃，维持8h，之后以2℃/h 升温至6℃，继续升温至20℃保温2h，二次干燥完成，压塞出箱。

冻干曲线2：将冻干箱温度最短时间降温至-30℃后将分装好的疫苗半成品快速入箱，制品温度到达-30℃保温2h 确保制品全部冻实。之后抽真空进入一次干燥阶段，8h 升温至-8℃，维持6h，之后以2℃/h 升温至8℃，继续升温至20℃保温2h，二次干燥完成，压塞出箱。

冻干曲线3：疫苗半成品常温入箱，将板层温度降至-5℃，维持1h，保证半成品表面形成薄层结晶，降低冻干箱压力至0.2kPa，维持1h，之后降温待冻干制品温度达到-30℃保温2h，2h 后抽真空升温进入一次干燥阶段，8h 升温至-8℃，维持6h，之后以2℃/h 升温至8℃，继续升温至20℃保温2h，压塞出箱。

1.2.3 冻干曲线重复验证

取鸡新城疫La Sota 株病毒液、鸡传染性支气管炎病毒H120 株病毒液各3 批，按照1.2.1、1.2.2 试验方法优选的保护剂配方TR4 和冻干曲线2 制备3 批疫苗，按照1.2.1（3）方法进行疫苗性状检查、病毒含量测定（包括冻干前、冻干后）和耐老化试验测定，来验证优选冻干工艺稳定性。

2 结果

2.1 不同保护剂配方疫苗评价结果

2.1.1 不同保护剂配方疫苗性状检测

从表1 看出H1～H6 疫苗冻干性状均为海绵状疏松团块，色泽均匀，易脱壁，加入稀释液后H2～H6 疫苗迅速溶解，H1 疫苗溶解缓慢。

表1 疫苗性状检验结果

2.1.2 不同保护剂配方疫苗病毒含量检测及耐老化试验

从表2 可以看出不同保护剂配方疫苗，新城疫病毒效价为106.25-6.45EID50/ 羽份，其冻干损失为0.05～0.25 个滴度，鸡传染性支气管炎病毒效价为104.24-4.5EID50/ 羽份，其冻干损失为0～0.26个滴度，从冻干损失上看H1～H6 疫苗均符合试验要求。

表2 病毒含量检测及耐老化试验结果

由37℃10d 耐老化试验结果可以看出，H4疫苗耐老化试验检测结果最优，37℃放置10d，新城疫病毒效价损失0.16 个滴度，鸡传染性支气管炎病毒效价损失0.22 个滴度。

由上述结果可知H4 疫苗耐老化试验抗原损失最小，故选用TR4 冻干保护剂配制疫苗进行后续冻干曲线优化试验。

2.2 冻干曲线优化试验

2.2.1 耐热保护剂冻干参数测定结果

冻干参数测定为冻干曲线设计提供参考。冻干过程中预冻温度须低于共晶点10℃左右，因此将预冻温度设置为-30℃，且保持2h 以上，确保样品冻实。原保护剂的塌陷温度约为-22℃，由2.1 试验结果筛选出的TR4 冻干保护剂中添加海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和甘露醇，由保护剂TR4 配制疫苗的塌陷温度为-17.4℃，明显提高制品的塌陷温度，而一次干燥的效率与塌陷温度呈正相关[9]，后续冻干曲线优化试验可通过提升一次干燥温度，缩短升温时间从而提升一次干燥效率。

2.2.2 冻干曲线优化试验结果

从表3、4 可知，冻干曲线2 冻干时间最短，较冻干曲线1 缩短17h，较冻干曲线3 缩短2h，并且冻干性状良好；冻干曲线3 疫苗产品性状较差。冻干曲线2 疫苗鸡新城疫病毒冻干损失0.14个滴度、鸡传染性支气管炎病毒冻干损失0.24 个滴度，37℃放置10d 鸡新城疫、传染性支气管炎病毒效价损失均小于0.3 个滴度；从疫苗性状、冻干时长和病毒含量综合比较分析TR4 疫苗优选冻干曲线2。

表3 不同冻干曲线疫苗性状检验结果

表4 病毒含量及耐老化试验测定结果

2.3 冻干曲线重复验证检测结果

由表5、6 可知，采用冻干保护剂TR4 和冻干曲线2 制备的3 批鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗性状检验均合格，疫苗冻干过程中，新城疫病毒效价损失均在0.19 个滴度以内，鸡传染性支气管炎病毒效价损失均在0.15 个滴度以内。3 批疫苗37℃放置10d，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎病毒效价损失均在0.3 个滴度以内，证明该疫苗优选冻干工艺稳定。

表5 3 批疫苗冻干性状检验结果

表6 3 批疫苗病毒含量检测及耐老化试验结果

3 讨论

应用疫苗免疫预防是动物疫病防控最有效的技术手段，选用合适的保护剂对疫苗的质量及疫苗的运输保存提供了重要的保障[10]。现有的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗37℃保存10日抗原损失在1 个滴度以内，抗原受温度影响较大[4]，本次试验在原有基础上进一步开展配方优化，提升疫苗的稳定性，同时开展冻干曲线优化设计，降低生产能耗。

本次试验设计了6 组不同的冻干保护剂配方，优选的TR4 中含有海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和甘露醇。海藻糖具有良好的抗冷冻脱水性能；聚乙烯基吡咯烷酮能提升玻璃转化温度并且抑蛋白变性，提高保护剂对病毒保护效果；甘露醇作为赋形剂，科学的用量能够提升冻干毒液的塌陷温度，使疫苗塌陷温度由原保护剂-25.23℃提高至-17.41℃；制备的疫苗鸡新城疫、鸡传染性支气管炎冻干损失与耐老化试验损失均小于

0.3 个滴度，保护效果好。

优选的冻干曲线2，预冻阶段满足制品温度低于共晶点10℃左右，并且恒温2h 保证制品完全冻实[11,12]；通过快速冻结制品缩短预冻时间，提高一次干燥温度和干燥速率[13-15]，缩短一次干燥时间，将冻干时长由45h 缩短至28h，总冻干时长缩短了17h，并且保证了冻干效果。

用TR4 保护剂配制疫苗应用冻干曲线2 冻干进行了三次重复验证试验，三次试验结果冻干性状良好，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎抗原损失与耐老化损失均小于0.3 个滴度，表明此次试验筛选出的冻干工艺安全稳定可用于后续疫苗生产。

4 结论

本研究获得鸡新城疫、传染性支气管炎二联耐热保护剂活疫苗的最佳冻干保护剂TR4，其冻干损失和耐热损失均在0.3 个滴度以内，有效保证疫苗质量；本研究优选的鸡新城疫、传染性支气管炎二联耐热保护剂活疫苗最佳冻干曲线为冻干曲线2，在保证品质的情况下冻干时长较原冻干曲线减少17h，大大提高了生产效率。