仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性 检测

张新慧 陈鸿真

摘  要：本试验采用细菌分离培养、形态学观察、生化试验和PCR方法对采集的患呼吸道病死亡的仔猪鼻拭子、肺脏、胸腔积液等病料进行副猪嗜血杆菌分离鉴定；采用人工感染小鼠试验和纸片扩散法（Kirby-Bauer，简称K-B法）分别检测分离株的致病性和耐药性。结果分离到1株副猪嗜血杆菌，并命名为HS-1株；分离株HS-1能引起小鼠发病与死亡，且死亡率为100％为致病性副猪嗜血杆菌；分离株HS-1对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松等6种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶等8种药物耐药，以期为该地区仔猪副猪嗜血杆菌合理用药及防控提供参考。

关键词：副猪嗜血杆菌；致病性；药敏试验；仔猪

中图分类号：S855.1+2 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2023）03-0056-04

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的一种传染性呼吸道疾病。该病常见临床症状为纤维素性胸膜炎、呼吸困难及关节炎等；副猪嗜血杆菌病具有较高的感染率和致死率，给养猪业造成严重的经济损失[1-2]。在养猪生产过程中，副猪嗜血杆菌病可通过不同途径感染不同年龄段的猪，尤其是4～8周龄仔猪，且经常与猪圆环病毒病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性病毒病混合感染，导致动物死亡加快，给临床诊断带来一定的困难[3-4]。

仔猪副猪嗜血杆菌病已经成为多个国家和地区猪群中普遍流行的疾病之一，不同的国家与地区流行的仔猪副猪嗜血杆菌血清型具有差异性，导致疫苗制备存在一定的困难[5-6]。由于抗菌药在临床的广泛应用，导致副猪嗜血杆菌产生了严重的耐药性，给该病的临床治疗带来了一定的困难，同时也严重危害着人们的健康[7]。

本试验通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验和PCR方法对副猪嗜血杆菌进行分离鉴定、致病性和耐药性分析，以期为该地区仔猪副猪嗜血杆菌合理用药及防控提供参考。

1  材料与方法

1.1 病料

2023年2月，采集某规模化猪场中因呼吸道疾病致死的仔猪鼻腔、肺脏、胸腔积液等组织或黏液样本4份。

1.2 细菌分离与培养

在无菌条件下，将采集的鼻拭子、肺脏、胸腔积液等病料样本接种于巧克力培养基上，在37 ℃恒温培养箱（5％CO2）培养12～18 h后，挑取培养基上单个的典型菌落，革兰染色，置于显微镜下观察其形态。

1.3 细菌生化特性鉴定

挑取培养基上典型菌落，接种于胰酪大豆胨（tryptone soy broth，TSB）液体培养基中。在37 ℃恒温培养箱中震荡培养12～18 h后，用无菌的TSB液体培养基将菌液浓度调整为0.5个麦氏浊度，按照革兰阳性菌的生化试剂盒说明书对分离菌株进行生化试验鉴定。

1.4 细菌PCR鉴定

参照杜炎斌等[4]报道的方法，设计副猪嗜血杆菌分离株鉴定引物。引物序列为F1：5'-TACGGCTACCTTGTTTTG-3'；F2：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'，由深圳华夫基因股份有限公司合成，提取分离株HS-1的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。

1.5 致病性试验

在无菌条件下，挑取巧克力培养基上单个的典型菌落，接种于TSB液体培养基中，在37 ℃恒温培养箱中震荡培养至对数生长期，利用菌落计数法对HS-1株进行计数，用TSB液体培养基将菌液浓度调整至107 CFU/mL。攻毒组和对照组分别为5只昆明系小鼠，攻毒组小鼠腹腔注射剂量为0.25 mL/只，对照组小鼠腹腔注射0.25 mL/只TSB液体培养基，在试验期间观察小鼠发病情况，并对死亡小鼠进行细菌学鉴定，试验期为6 d。

1.6 药敏试验

药敏试验参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的要求对分离株进行药敏试验和耐药性结果判断。

2  结果

2.1细菌分离培养

疑似副猪嗜血杆菌的HS-1株在巧克力培养基上培养，利用革兰染色镜检观察其形态学（图1）。HS-1株培养特性和形态学与《伯杰氏细菌鉴定手册》中报道的副猪嗜血杆菌的培养特性和形态学基本一致。

2.2 细菌生化鉴定结果

生化特性结果显示，HS-1株硝酸盐还原酶、接触酶为阳性，分解葡萄糖、果糖；氧化酶试验、吲哚试验、脲酶试验、甲基红（Methyl red，MR）试验及Voges-Proskauer（VP）试验为阴性，不分解甘露醇。与《伯杰氏细菌鉴定手册》中报道的副猪嗜血杆菌的生化特性基本一致，HS-1株生化特性鉴定结果为副猪嗜血杆菌。

2.3 细菌PCR鉴定

对分离的HS-1株进行PCR鉴定。结果显示，PCR扩增出大约为822 bp的目的条带（图2）。对HS-1株的PCR产物进行测序，其测序结果与GenBank中的副猪嗜血杆菌基因序列同源性为98.9％～99.0％，表明HS-1株为副猪嗜血杆菌。

2.4 致病性试验

攻毒组的5只小鼠在攻毒后2～3 d出现了精神沉郁、采食量减少、呼吸困难等临床症状，攻毒的小鼠相继出现死亡，第6天5只小鼠全部死亡，对照组小鼠无临床症状，健康存活。剖检攻毒组小鼠，采集病料组织，分离得到了副猪嗜血桿菌。致病性试验结果表明，HS-1分离株为致病性副猪嗜血杆菌。

2.5耐药性分析

采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，简称K-B法）检测HS-1株对常用抗菌药的耐药性，判定结果为耐药（R）、敏感（S）、中敏（I）（表1）。

由表1可知，分离的HS-1株对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松、多西环素、替米考星、氟苯尼考6种药物敏感；对阿莫西林、氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、多黏菌素、恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素、林可霉素8种药物耐药。说明分离的HS-1株对临床中常用的药物具有不同的耐药性。

3 讨论

近几年，随着规模化养殖业的迅速发展，猪的饲养量呈现逐年增多的趋势，但副猪嗜血杆菌病作为养猪業常见的传染性疾病，可感染不同年龄段的猪，尤其是仔猪，具有发病急、高死亡率等特点，严重危害着我国养猪业的发展[1-4]。副猪嗜血杆菌广泛存在于饲养环境中，可以通过多种途径在不同猪群之间传播，尤其是猪免疫力下降时更容易引发副猪嗜血杆菌病[7-8]。本试验从患呼吸道病死亡的仔猪鼻拭子、肺脏、胸腔积液等病料中分离得到1株致病性副猪嗜血杆菌HS-1株，通过药敏试验结果显示，分离株HS-1对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松等6种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶等8种药物耐药。说明分离的副猪嗜血杆菌对常用抗菌药产生严重的耐药性。因此，在临床防治副猪嗜血杆菌中应进行药敏试验，选择敏感的药物进行交替使用，应注意副猪嗜血杆菌病的疫苗免疫，同时配合环境的消毒，提高其治疗效果。

参考文献

[1] 肖敏，刘建，卢昌，等．副猪嗜血杆菌的分离鉴定与灭活疫苗的初步研制[J]．动物医学进展，2022，43（8）：35-40．

[2] 赵自亮，田宇森，庄鸿琨，等．副猪嗜血杆菌与PCV3混合感染的实验室诊断及分析[J]．中国动物检疫，2022，39（12）：18-25．

[3] 范春梅．湖南省部分家庭猪场呼吸道疾病流行病学调查分析[J]．中国猪业，2020，15（5）：80-83．

[4] 杜炎斌，袁丽英，东笑，等．英德市某规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验[J]．动物医学进展，2022，43（6）：32-36．

[5] 冯建远，吴廷瑛，郭旋，等．广西规模化猪场呼吸道病原菌调查及耐药性分析[J]．中国猪业，2020，15（2）：66-69．

[6] 陈超群，陈佳莉，周萱仪，等．β-内酰胺类药物对副猪嗜血杆菌流行病学临界值的建立及耐药性的测定[J]．畜牧兽医学报，2021，52（11）：3234-3245．

[7] 王庆云．安阳地区副猪嗜血杆菌分离株的耐药性与耐药基因检测[J]．动物医学进展，2021，42（4）：131-134．

[8] 王同兆，张付贤，雷连成．1株副猪嗜血杆菌血清4型的分离鉴定及耐药性分析[J]．中国畜牧兽医，2022，49（3）：1096-1105．