ssRNA病毒侵染宿主细胞与细胞抗病毒作用的研究进展

谢春芳 于瑞嵩 董世娟 陈冰清 李春华

摘  要：单链RNA（single-strand RNA，ssRNA）病毒是感染人和动物的主要病原体之一，部分ssRNA病毒感染宿主后会对宿主产生致命的影响，也有部分ssRNA病毒进入宿主后不会引发明显的病变和临床症状。ssRNA病毒与宿主细胞之间的感染与抗病毒所产生的炎症反应、细胞凋亡、细胞溶酶体/自噬应答均是动物机体在ssRNA病毒入侵后产生的一系列抗病毒活动。大量研究解析了ssRNA病毒与宿主细胞之间的相互关系，但仍有许多未知领域阻碍着抗ssRNA病毒研究的前进步伐。基于已公开发表的研究论文，笔者梳理并分析了ssRNA病毒与被侵染细胞之间的相互关系，为后续研究ssRNA病毒与宿主细胞应答反应提供理论支持。

关键词：ssRNA病毒；宿主细胞；抗病毒炎症反应；凋亡和自噬应答

中图分类号：S852 文献标志码：A       文章编号：1001-0769（2023）03-0078-07

感染人和哺乳动物细胞的RNA病毒主要是单链RNA（single stranded RNA，ssRNA）病毒。ssRNA病毒可引起神经系统、免疫系统、心血管系统、消化系统、呼吸系统和生殖系统的各种损伤，从而产生各种症状，如出血热、心肌炎、肺炎、免疫缺陷和生殖系统疾病、腹泻和代谢紊乱，威胁人和动物的健康，增加病毒的传播[1-8]。

ssRNA病毒主要有正义单链RNA（positive-sense single-strand RNA，+ssRNA）病毒、反义单链RNA（negative-sense single-strand RNA， -ssRNA）病毒和反转录（retrovirus）病毒三种，其中反转录病毒是一类具有编码逆转录酶的单链RNA病毒。+ssRNA病毒来自冠状病毒科（Coronaviridae）、黄病毒科（Flaviviridae）、小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）和一些肝炎病毒科的成员[9-11]。如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2）、黄热病病毒、登革热病毒（Dengue virus，DENV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、小核糖核酸病毒、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV），戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）[12-17]。-ssRNA病毒主要来自副黏病毒科，如流感病毒[18]。在反转录病毒中，研究比较多的是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV），病毒进入细胞核，将RNA反转录为cDNA，然后进行复制、转录和翻译[19-20]。

机体的应激反应、炎性反应、天然免疫应答是动物最先产生的对外来入侵病原体的防御屏障，在病毒感染期间，一些热应激蛋白（heat shock protein，HSP）与免疫相关因子相互作用，可以抑制病毒增殖，并激活免疫应答来保护宿主细胞，发挥抗病毒作用，维持细胞的稳态，或调节炎性相关蛋白的表达，启动细胞炎性抗病毒反应信号途径，诱导干扰素的产生，抑制病毒复制；或者调节细胞凋亡相关蛋白的表达，诱导细胞凋亡；同时，一些HSP也会被病毒“劫持”，帮助病毒入侵、复制和成熟，从而增加病毒在宿主细胞内不利条件下存活的机会[21]。

当病毒在宿主细胞内复制增殖的数量不断增加时，细胞溶酶体/自噬体无法及时清除呈指数级增殖的大量病毒、病毒蛋白及病毒RNA，造成细胞内饥饿应激、压力应激等细胞稳态失衡，细胞启动凋亡信号途径，以终止病毒在细胞内的复制、转录、翻译和增殖等一系列病毒借助于细胞环境及资源而产生的生命活动。

1  ssRNA病毒的吸附和入侵

ssRNA病毒通过病毒蛋白与细胞受体结合，使细胞膜融合或通过细胞内吞途径进入宿主細胞。病毒入侵细胞时细胞膜发生重排，重排后的细胞膜包裹病毒核酸蛋白体进入细胞质中。在冠状病毒中，病毒的刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S蛋白）是与细胞受体结合的蛋白，对进入宿主细胞至关重要，其N末端S1片段与细胞受体结合，C末端S2片段促进细胞-细胞膜融合。S蛋白S1/S2裂解位点的双精氨酸基序（RxxR）是膜融合的“开启”元件，但裂解位点在不同病毒间是不固定的，裂解位点的个数也有差异。如猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）附着在细胞膜上，然后通过钙黄嘌呤介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis，CME）或小窝介导的内吞作用（caveolae-mediated endocytosis，CavME）进入细胞浆，形成一个被网格蛋白包裹的小泡，随后运输到细胞核附近。在黄病毒中，病毒在低pH环境中与细胞膜融合，同样以网格蛋白依赖的方式进入细胞质[22-24]。

副黏病毒科的鸡新城疫病毒（Newcastle disease viruses，NDV）具有多种入侵细胞的途径，可以在中性pH环境中与细胞膜受体蛋白结合并发生膜融合，而直接进入细胞质，也可以在低pH的条件下通过内吞途径进入宿主细胞，但是副黏病毒科和逆转录病毒的直接膜融合入侵机制是否这么简单，有待进一步深入研究[25-26]。

2  ssRNA病毒的复制、转录和翻译

+ssRNA病毒进入细胞后，会“劫持”宿主细胞材料和合成机制来编码其结构蛋白和非结构蛋白，同时合成负义RNA作为产生新病毒的模板[27]。+ssRNA病毒通过RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）反应将一个或多个核苷酸连接到靶蛋白上，使核苷酸酰化。核苷酸的酰化启动病毒RNA的转录和病毒蛋白的翻译，这个过程中RdRp起着关键的作用。RdRp主要参与+ssRNA病毒和-ssRNA病毒基因组的RNA合成和转录，RdRp的酶催化需要Mg2+或Mn2+二价阳离子的存在，复制RNA基因组以形成复制模板，从而产生更多的单链RNA，成为新合成的病毒粒子的基因组[28]。

-ssRNA病毒如流感病毒进入细胞质后，病毒RNA片段被RdRp结合成RNA蛋白复合物，从细胞质运输到细胞核，使RNA片段转录为信使RNA（messenger RNA，mRNA），并将RNA片段复制为互补RNA（complementary RNA，cRNA），以复制更多的RNA；mRNA从细胞核释放后，在细胞质中翻译成病毒蛋白，其中病毒核蛋白被输入细胞核与RNA片段结合，形成病毒RNA蛋白（viral ribonucleoprotein，vRNP）复合体，vRNP被输出到细胞质后被病毒的结构蛋白组装成病毒核心[18]。

与+ssRNA和-ssRNA不同，反转录病毒进入细胞后，病毒RNA必须被逆转录为双链cDNA，然后进入细胞核，将病毒基因整合到宿主细胞DNA中，以转录和复制病毒mRNA和蛋白，在细胞核和细胞质之间穿梭，反转录病毒从细胞核输出未折叠的RNA，输送到内质网、高尔基体中，进行病毒粒子的蛋白折叠、组装，一些被泛素化的病毒蛋白具有促进病毒复制的作用[29]。

3  ssRNA病毒的释放

病毒进入宿主细胞，经过复制、转录、翻译后，被包裹到内质网腔中，在病毒感染的过程中，会产生大量RNA聚合酶，并将其集中在滑面内质网产生的液泡（solid membrane vesicle，SMV）膜上[30]。RNA病毒利用内质网作为膜源重排膜，来建立其复制场所，即双膜囊泡（double-membrane vesicle，DMV），+ssRNA病毒诱导的囊泡类似于具有双脂质双层的自噬液泡[31]。囊泡运输主要依靠微管网络向细胞外周来回移动[32]，所以推测病毒囊泡也是沿着细胞微管移动。

冠狀病毒通过将内质网吞噬受体蛋白“劫持”并缩合聚集，达到抑制内质网吞噬病毒的作用，从而促进病毒DMV的形成，进而促进病毒复制增加，新生病毒随后被输送到高尔基体中，在高尔基体衍生的囊泡中组装，并激活内质网应激[33-34]；口蹄疫病毒翻译组装的新一代病毒，从内质网通过囊泡运输到高尔基体，最终到达细胞膜[35]。

4  细胞促炎性因子和干扰素的表达抑制ssRNA病毒复制

ssRNA病毒与宿主细胞结合后，细胞受到病毒刺激后，HSP表达上升，其中HSP40的家族成员DNAJA3与病毒蛋白（如冠状病毒的S蛋白）结合，影响病毒对细胞的吸附，抑制病毒的复制[36]；另外HSP70与细胞膜上的Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）相互作用，激活TLR信号途径，诱导干扰素的产生，起到抑制RNA病毒的作用[37]。TLRs不仅能够识别外来入侵蛋白，还有识别外来RNA的能力[38]。位于细胞膜上的TLRs有TLR2、TLR4和TLR6；位于细胞质内的TLRs有TLR3、TLR7、TLR8。进入细胞质内的病毒可以激活TLR3、TLR7或视黄酸（也称“维甲酸”）诱导基因蛋白I样受体（retinoic acid induces gene protein I-like receptor，RLR）和黑色素瘤分化相关抗原（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5），这些模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）是天然免疫反应信号系统的组成部分，具有检测各种病原体成分的功能，TLRs检测到外来病原体和RNA后被激活，促进炎性细胞因子的分泌，如白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、干扰素（interferon，IFN），激发细胞炎症反应，阻止病毒的吸附侵入，抑制病毒的复制，并把病毒RNA从内质网带入细胞溶酶体（lysosome）进行降解[39-40]。

环鸟嘌呤腺嘌呤合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）是细胞中DNA的识别受体，+ssRNA病毒能够在不逆转录其基因组的情况下激活cGAS-STING途径，+ssRNA病毒触发cGAS的机制目前尚不清楚。登革热病毒非结构蛋白4B（non-structural protein 4B，NS4B）可以使线粒体伸长，这一过程能使线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）释放到细胞质中，激活cGAS和cGAMP的产生，激活cGAS介导的干扰素基因的刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）和IRF3的核转位，导致干扰素刺激基因（interferon stimulating gene，ISG）的激活，诱导天然免疫产生的抗病毒反应；HIV同样能激活cGAS-STING干扰素信号途径[41，42]。

当细胞引发过度的炎症反应时，HSP60通过调节RNA病毒识别受体RLR和与外来RNA监测蛋白MDA5相关的RLR/MDA5信号通路，抑制干扰素的表达，抑制炎症反应[43]。

5  细胞溶酶体降解ssRNA病毒途径

溶酶体是细胞降解外来病原体、错误折叠蛋白、细胞代谢物质的细胞器，溶酶体中的酸性pH由液泡型质子转位ATP酶（vacuolar-type proton-translocating ATPase，V-ATPase）维持，酸性pH是降解蛋白质、脂类和糖类生物分子的关键条件。溶酶体也可与细胞内体融合。溶酶体相关膜蛋白（lysosomal associated membrane protein，LAMP）的表达通常与保护溶酶体膜通透性有关[44-45]，对溶酶体的降解起调控作用。

自噬是将细胞废弃物（细胞器、蛋白质、脂质和糖原）输送到溶酶体中进行降解的活动，是细胞的保守分解代谢途径，是一种循环降解系统，以维持细胞稳态保持良好状态。自噬有小自噬（microautophagy）和大自噬（macroautophagy）之分，溶酶体自身可以吞噬少量的泛素化标记的细胞废弃物，称为小自噬；常见的自噬一般是大自噬。大自噬过程可分为内质网形成自噬体捕获泛素化标记的待降解的蛋白质，然后自噬体与溶酶体外膜融合，自噬体把捕获物连同内膜转移到溶酶体中，成为酸性两栖体即自溶体，自溶体中的内容物包括自噬体内膜，最终都被溶酶体降解[46]。

自噬的发生由未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）引发的内质网应激所控制[45]。大量病毒翻译后，未折叠的病毒蛋白、病毒RNA聚集在内质网膜上，引起内质网未折叠蛋白反应，被细胞进行泛素化标记，启动自噬。自噬起始于细胞内质网-线粒体的接触点，自噬特异性蛋白自噬相关基因14（autophage-related gene 14，ATG14）开始锚定到接触点上，自噬隔离膜开始形成，隔离膜夹在2个内质网腔中间，其中一个形成狭长的延伸，即Ω形状的双膜自噬体，形成自噬体的隔离膜，在吞噬被泛素化的病毒蛋白、RNA等废弃物时，自噬体形成并伸长[47-49]。

溶酶体、内体、自噬体等具有囊泡的双膜结构物，囊泡运输主要依靠微管网络和相关的运动蛋白，可由细胞外周区向核周区移动，也可由核周区向外周区移动，分别由正向驱动蛋白和反向驱动蛋白驱动囊泡移动[50，51]。

6  细胞凋亡对ssRNA病毒生死存亡的影响

细胞的凋亡程序启动细胞膜上的死亡受体激活；启动细胞质中线粒体凋亡信号途径；启动内质网应激诱导细胞凋亡的发生。在细胞膜上，冠状病毒的一些结构蛋白和辅助蛋白可以刺激细胞膜上的死亡受体，激活天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）的级联信号途径，诱导细胞凋亡[52]。

正常情况下，在细胞质中，HSP具有重新折叠被错误折叠的蛋白质功能，共同消除不可逆损伤的蛋白质，维持细胞周期、细胞增殖和细胞稳态，使细胞免于凋亡，其中HSP60是一个线粒体蛋白，胞质中的HSP60與促凋亡因子（B-cell lymphoma 2-assiociated x，Bax）形成复合物，抑制Bax向线粒体的移动，起到抑制细胞凋亡的作用[53]；HSP70结合凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）来阻断细胞凋亡。当细胞面临病毒对蛋白质等营养物质的竞争，面临饥饿、缺氧环境、内质网应激状态时，细胞的内在凋亡信号途径被激活，启动细胞凋亡程序，细胞通过自杀式的死亡与病毒“同归于尽”，维持细胞大环境稳态。在细胞凋亡期间，HSP不仅具有抑制细胞凋亡的作用，同时还有抑制病毒复制的作用[54]。

7  讨论

ssRNA病毒可以感染的动物物种繁多，引起的疾病类型多种多样，许多病毒可以跨种传播。因为RNA病毒的易变特性，造成的伤害程度有严重的，有轻微的，尽管差异大，但ssRNA病毒在宿主细胞中的侵染过程和细胞的抗病毒反应还是遵循许多相同的规律。

首先ssRNA病毒基本依赖蛋白与受体结合侵入细胞，细胞感受到病毒侵袭后，积极迅速激活促炎性细胞因子和干扰素的表达，抑制病毒的入侵和复制。假如病毒的毒力低，感染的量少，病毒会在感染初始阶段被细胞的天然免疫力屏蔽或抑制，而后被细胞降解系统吞噬降解掉。假如ssRNA病毒冲破细胞的促炎性细胞因子和干扰素的抗病毒防疫屏障，进入细胞内质网或细胞核“劫持”细胞相关蛋白和基因，进行病毒基因的复制、转录（反转录）和蛋白的翻译表达，并利用重排内质网膜作为病毒囊泡，成为病毒在细胞中的安全生产场所，屏蔽细胞的自噬体、溶酶体的捕获、降解系统，同时利用细胞动力蛋白，驱动病毒囊泡运动，从侵染细胞中快速逃逸。细胞在大量病毒蛋白、RNA和cDNA的应激下，启动溶酶体/自噬体代谢系统，捕获大量病毒蛋白、RNA或cDNA，进入自溶体降解消化。

大量病毒蛋白、RNA和cDNA在细胞内质网的堆积，使细胞线粒体受到损伤，细胞稳态受到冲击，细胞各种凋亡因子被激活，启动凋亡信号途径进行细胞程序性死亡，达到抑制病毒复制增殖等活动。病毒为了完成子代病毒的复制、转录、翻译、组装、增殖、传播所有过程，争取足够的时间，抑制细胞的凋亡性死亡。热休克蛋白在细胞凋亡期间，一方面起保护细胞的作用，抑制细胞凋亡发生，另一方面抑制病毒的复制。细胞与ssRNA病毒之间的存亡，取决于病毒的复制速度、攻击力及在细胞内的应变能力和细胞的应答反应时间、防御能力，降解病毒能力，是病毒和细胞全方位综合能力的较量。

到目前为止，许多由ssRNA病毒引发的疾病没有有效的防治疫苗或药物，了解病毒侵染细胞的过程，病毒在细胞中的生命周期活动，以及被侵染的宿主细胞所产生的防御、降解的抗病毒应答系列活动，可以为更好地解决由ssRNA病毒引起的疾病，提供理论依据和突破点。

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