胶束中柚皮素与紫杉醇的含量测定

马少青,张丁强,王学瑞,于可可,蒲晓辉,袁琦

河南大学 药学院,河南 开封475001

柚皮素(Naringin,NAR)是由芸香科植物葡萄柚及柑橘类水果中提取的黄酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种药理活性,可以调节机体免疫功能,抑制肿瘤生长[1-3]。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是一种具有抗癌活性的二萜类生物碱化合物,属于微管稳定剂,可以稳定分裂间期细胞的微管蛋白,从而阻止癌症细胞的有丝分裂[4]。

紫杉醇前药装载柚皮素胶束(NAR/MDSP 胶束),利用MDSP(聚乙二醇单甲醚-去氧胆酸-二硫键-紫杉醇)胶束中二硫键的还原敏感性和聚乙二醇-去氧胆酸的抗多药耐药性,可以实现多靶点、多环节、高效率的传输药物。而NAR 能够激活体内免疫细胞,释放大量免疫因子[5]。因此,NAR/MDSP胶束可以延长NAR 与PTX 在体内的循环时间,实现NAR 与PTX 的共同递送,达到双靶向协同抗肿瘤MDR 的智能释药。本文提供了一种同时测定NAR/MDSP 胶束中NAR 和PTX 含量的方法,该方法简便、准确,可用于快速测定胶束中NAR和PTX 的含量,为NAR/MDSP胶束的进一步研发提供数据支撑,助力于双靶向协同抗肿瘤MDR 智能释药型纳米药物紫杉醇前药装载柚皮素胶束的研究。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

柚皮素对照品(潍坊华植生物科技有限公司,批号:CAS480-41-1),紫杉醇对照品(南京景竹生物科技有限公司,批号:CAS33069-62-4),甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯;紫杉醇前药MDCP(聚乙二醇单甲醚-去氧胆酸-丁二酸酐-紫杉醇)和MDSP(聚乙二醇单甲醚-去氧胆酸-二硫键-紫杉醇)(实验室自制)。

1.2 实验仪器

Waters高效液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司;紫外可见分光光度计UV-2600(日本岛津公司);超声波清洗仪(北京泰元达精密清洗机);雷磁PHS-3C PH 计(杭州美尼特自动化仪表有限公司);ZWY-103D 型恒温培养振荡器(长沙诺达仪器设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 NAR/MDSP胶束的制备

2 mg NAR 和10 mg MDSP溶于10 mL的甲醇,室温下搅拌45 min,1 800 r·min-1旋干后加入15 mL超纯水,45 ℃油浴1 400 r·min-1搅拌2 h,3 000 r·min-1离心10 min,制得NAR/MDSP 胶束。

2.1.2 溶液的制备

①NAR 和PTX 对照品混合储备液

分别精密称取NAR 对照品和PTX 对照品,用甲醇溶解后定容,摇匀,制成混合对照溶液作为对照储备液。其中NAR 的浓度为10.00μg·mL-1,PTX 的浓度为10.02μg·mL-1。

②MDSP溶液

精密称取自制MDSP材料,用甲醇进行定量稀释。

③NAR/MDSP胶束溶液

精密称取制备的NAR/MDSP 胶束,用甲醇进行定量稀释。

2.2 色谱条件

色谱柱:Waters Symmetry C18色谱柱(250×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇∶水=72∶28(V∶V),检测波长227 nm,柱温30 ℃,流速1 mL/min,进样量20μL。NAR 与PTX 的分离度为5.750,峰形良好。

2.3 系统适用性试验

取NAR 和PTX 对照品混合储备液稀释后进样,记录色谱图。NAR 与PTX 的保留时间分别为9.975 min和4.495 min,峰形良好。稀释后的NAR和PTX 对照品混合储备液重复进样6次,NAR 峰面积的相对标准偏差为1.003%,PTX 峰面积的相对标准偏差为1.061%,NAR 和PTX 峰面积的相对标准偏差均小于2.0%。系统适用性符合要求。

2.4 专属性试验

分别取阴性对照品溶液(空白溶剂)、MDSP材料、NAR/MDSP胶束、NAR 和PTX的对照品混合溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,结果见图1。

由图1可知,溶剂阴性对照品溶液在4.495 min和9.975 min均无吸收。对照品混合溶液在4.495 min和9.975 min产生吸收,说明NAR 的保留时间为4.495 min,PTX 的保留时间为9.975 min。MDSP的溶液在4.495 min无吸收,在9.975 min有明显吸收,说明MDSP 对NAR 的测定无干扰,在9.975 min的吸收峰是MDSP中PTX 产生的吸收。NAR/MDSP胶束在4.495 min和9.975 min均有吸收,为NAR/MDSP胶束溶液中NAR 和PTX 产生的吸收。由图1～4可知,NAR 和PTX 的色谱峰峰形良好,无干扰峰,且分离度符合要求。表明方法专属性强,可用于紫杉醇前药装载柚皮素胶束中同时测定柚皮素与紫杉醇的含量。

图1-1 阴性对照品的HPLC图

图1-2 NAR和PTX的HPLC图

图1-3 MDSP材料的HPLC图

图1-4 NAR/MDSP胶束的HPLC图

2.5 线性范围

精密量取NAR 和PTX 的对照品混合储备液用甲醇稀释,得NAR 的PTX 的梯度混合标准溶液,NAR的浓度分别为0.312 5、0.625 0、1.250、2.500、5.000、和10.00μg·mL-1,PTX 的浓度分别为0.312 0、0.630 0、1.280、2.520、5.010、和10.02 μg·mL-1的溶液,按“2.2”项下条件,注入液相色谱仪,分别以质量浓度(x,μg·mL-1)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,结果见图2。NAR 的回归方程分别为:Y=81 183X+302.03,R2=0.999 9;PTX 的回归方程分别为:Y=71 381X-13 875,R2=0.999 9。结果表明,NAR 在0.312 5～10.00μg·mL-1,PTX 在0.312 0～10.02 μg·mL-1,峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

2.6 稳定性试验

取低中高三个浓度的NAR/MDSP 胶束溶液,分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h后,注入液相色谱仪,测定色谱峰面积,把峰面积带入2.5项下回归方程中,计算NAR 和PTX 的浓度,结果见表1。由表1 可知,NAR 和PTX 的RSD 值均小于1.5%,表明NAR/MDSP 胶束溶液在12 h 内稳定性良好。

图2 柚皮素的标准曲线、紫杉醇的标准曲线

表1 NAR和PTX稳定性试验结果(n=3)

2.7 精密度试验

取NAR/MDSP胶束溶液6份,其中NAR的浓度为5.000μg·mL-1,PTX 的浓度为5.010 μg·mL-1,注入液相色谱仪,测定色谱峰面积,把峰面积带入2.5项下回归方程中,计算浓度,结果见表2。NAR 的RSD 值为0.54,PTX 的RSD 值为0.97,均小于0.97%,符合规定。

表2 NAR和PTX重复性试验结果(n=3)

2.8 回收率试验

精密量取5ml,PTX 浓度为5μg·mL-1的MDSP溶液,置于10 mL 量瓶中,分别精密加入混合对照品储备液1.5、2.5和3.5 mL,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制备低、中、高3 个浓度的MDSP 胶束溶液,每个浓度制备3份样品,按2.2项下条件,注入液相色谱仪,测定色谱峰面积,把峰面积带入2.5项下回归方程中,结果见表3。

表3 NAR和PTX的回收率实验结果(n=3)

2.9 NAR/MDSP胶束中NAR和PTX的测定

精密称取NAR/MDSP 胶束,用甲醇稀释,定容,配制成1mg·mL-1的溶液,按2.2项下条件,注入液相色谱仪,测定色谱峰面积,把峰面积带入2.5项下回归方程中,计算NAR 和PTX 的浓度,结果见表4。

表4 NAR/MDSP胶束中紫杉醇和柚皮素的测定(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

分别取MDSP材料和NAR 对照品适量,溶于甲醇,以甲醇为空白,在200～600 nm 波长范围内进行扫描,得到图3。在图3 中,MDSP 在227 nm有明显吸收,NAR 在227 nm 和288 nm 有明显吸收,因此选择227 nm 做为紫杉醇前药装载柚皮素胶束中同时测定PTX 和NAR 的检测波长。根据MDSP的构成可知,MDSP 在溶液中可以释放出PTX。因此推测,MDSP溶液在227 nm 的吸收,是由PTX 产生的。

图3 NAR与MDCP、MDSP材料的检测波长图

3.2 溶剂的选择

我们考察了在室温下,NAR 对照品和PTX 对照品在纯化水和不同pH 值水溶液中的溶解度,结果见表5。NAR 在纯化水和不同pH 值水溶液中的溶解度都很小,NAR 在pH 5.8磷酸盐缓冲液中溶解度最大,但也只有42.54±0.24μg·mL-1,NAR 在纯化水中平衡溶解度仅为37.67±1.83 μg·mL-1,pH 7.4的磷酸盐缓冲液中平衡溶解度为35.91±0.32μg·mL-1。PTX 在纯化水和不同pH 值水溶液中的溶解度更小,在纯化水中最大,也仅为0.103±0.56μg·mL-1。表5中的数据说明,NAR 和PTX 均难溶于水[6]。因此,在进行方法学考察时,我们选择了甲醇作为溶剂。

表5 PTX和NAR在不同介质中的溶解度(n=3)

我们建立了HPLC 法同时测定紫杉醇前药装载柚皮素胶束中柚皮素与紫杉醇含量的方法,通过方法学验证,该方法简便、准确,可用于紫杉醇前药装载柚皮素胶束中柚皮素与紫杉醇的含量测定,为紫杉醇前药装载柚皮素胶束的研发提供数据支撑,可用于紫杉醇前药装载柚皮素胶束的表征,有助于新型抗癌药物紫杉醇前药装载柚皮素胶束的研究。