杜仲叶颗粒抗骨质疏松作用及其机制

杜丹凤 ,丁艳霞 ,李钦✉

河南省杜仲栽培与利用工程实验室,河南 开封475000

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身代谢性疾病,以骨量减少,骨微结构破坏,骨骼强度下降和骨折风险增加为特征[1]。OP是一个日益严重的全球性公共卫生问题[2]。OP在前期并无明显症状,又和慢性炎症性关节病、糖尿病、肾功能衰竭等共同发病[3],造成人们对骨质疏松症的忽略而延误治疗的最佳时机。因此,预防和治疗OP,改善社会健康,缓解医疗和经济负担势在必行。目前临床上治疗OP的药物有降钙素、雌激素、甲状旁腺素、钙制剂、维生素D 等。上述药物在治疗骨质疏松方面疗效显著,但它们的副作用也是很明显的,轻微者会引起呕吐,严重者会导致癌症、冠心病、血栓等疾病几率的增加。中医药治疗骨质疏松强调整体观念,辨证论治及治病求本原则。骨质疏松在临床上的病因病机很少单一存在,中医药治疗时以补肾填精为主要原则,脾、肝、心、肺与肾相互作用。因此,从中医药中寻找治疗骨质疏松的有效药物非常有意义。

杜仲叶(Eucommiae Folium)为杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥叶。夏、秋二季枝叶茂盛时采收,晒干或低温烘干。具有补肝肾、强筋骨的功效[4]。近年来,有关杜仲抗OP 作用的相关报道较多,但其研究对象主要是杜仲皮醇提物[5],杜仲皮水提物[6],杜仲皮中单体如杜仲总黄酮[7],松脂素二葡萄糖苷,松脂素[8]以及含有杜仲的复方[9-13]。有关杜仲叶水提物[14],杜仲叶醇提物[15]的治疗作用也有报道。但迄今为止,有关杜仲叶醇提物对OP作用的机制研究鲜有报道。本研究以杜仲叶醇提物为原料制备杜仲叶颗粒,以去卵巢骨质疏松大鼠为模型,通过测定大鼠股骨骨密度,观察杜仲叶颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠的作用。此外,本研究还评价了杜仲叶颗粒对大鼠血清骨代谢指标碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原羧基末端肽(CTX-1)的影响,并通过研究对wnt/β-catenin信号通路的影响,初步探讨杜仲叶颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠的作用机制。

1 材料

1.1 主要仪器

DXA 小动物双能X 射线骨密度仪(韩国osteosys);全波长酶标仪(美国Thermo公司);JB-P5包埋机,武汉俊杰电子有限公司;RM2016 病理切片机,徕卡;荧光定量PCR 仪,美国Bio-rad

1.2 药品与试剂

杜仲叶颗粒,实验室自制。雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片复合包装(批号360952,美国Abbott)。

大鼠CTX-1 ELISA 试剂盒(E-EL-R0939c),Elabscience,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒,南京建成生物工程研究所;EDTA 脱钙液(0.5M),苏木素染液、伊红染液,Servicebio;RNA 提取液,RIPA 裂解液,Servicebio。

1.3 实验动物

3月龄SD 雌性大鼠,体质量240 g左右,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供,实验动物许可证号:SCXK(鲁)2019-0003,实验动物使用许可证号:SYXK(豫)2016-0006,饲养于河南大学药学院清洁级动物实验室。实验期间大鼠自由摄水、取食。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

大鼠适应性喂养一周后,随机分为假手术组、模型组、西药组、杜仲叶颗粒低剂量组、杜仲叶颗粒中剂量组、杜仲叶颗粒高剂量组,每组7只。腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后,进行造模,其中,假手术组在卵巢周围切除少量脂肪,其余组行双侧卵巢摘除术。术后一周,各组灌胃给予相应药物,其中,杜仲叶颗粒低、中、高剂量组分别为1.30 g/kg、2.60 g/kg、5.20 g/kg,雌二醇组灌胃剂量为0.208 mg/kg,雌二醇组与杜仲叶颗粒低、中、高剂量组将药物溶于0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中,模型组与假手术组均灌胃0.5% CMC-Na。每日一次,连续12周。

2.2 骨密度检测

取各组大鼠右侧股骨,将其周围组织和肌肉剔除干净后,整齐摆放在双能X 射线骨密度仪的吸收测量台上。采用计算机在小动物梯级标准分析软件模式下,自动记录股骨整体的骨密度,并求平均值。

2.3 HE染色

取各组大鼠左股骨,分离附着肌肉组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h,放入EDTA 脱钙液(0.5M)中脱钙,连续1 mon。脱钙完成后,脱水,石蜡包埋,切片,切片后进行H&E 染色,脱水、透明、封片后在光学显微镜下观察骨组织形态。

2.4 骨代谢指标的测定

给药12 周后,腹主动脉取血,静置后离心(3 500 r/min,15 min),收集上层血清,-80 ℃保存备用。按相应试剂盒说明书,测定血清中ALP,CTX-1的含量。

2.5 qPCR

取大鼠股骨,加入液氮研磨匀浆,按Trizol试剂盒提取总RNA,反转录试剂盒将其反转录为cDNA,实时定量PCR法检测骨组织wnt3a、βcatenin、DKK1 m RNA表达量。以GAPDH为内参,采用2-△△Ct法计算各检测基因的相对表达量。见表1。

2.6 统计学分析

通过SPSS20.0 软件进行数据分析,计量资料以(x-±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为具有显著性差异,P＜0.01为具有极显著性差异。

3 结果

3.1 对OVX大鼠骨密度的影响

与假手术组比较,模型组大鼠股骨骨密度显著降低,提示造模成功;灌胃12周后,杜仲叶颗粒组、西药组均能显著升高大鼠骨密度。见表2。

3.2 对OVX大鼠股骨骨组织形态的影响

HE染色如图1,光学显微镜(×200)下观察发现,与假手术组比较,模型组大鼠股骨骨小梁变细,部分出现断裂,骨髓腔增大,出现大量空泡;与模型组比较,杜仲叶颗粒组与西药组对骨小梁形态、数量与连接情况均有改善,且骨髓腔减小,空泡数量减少。见图1。

图1 杜仲叶颗粒对OVX大鼠股骨组织形态的影响

3.3 对OVX大鼠血清骨代谢指标的影响

与假手术组比较,模型组大鼠血清中ALP,CTX-1含量显著增高;给药12 周后,与模型组比较,杜仲叶颗粒组能显著降低ALP、CTX-1含量,雌二醇组能显著降低ALP 含量,对CTX-1含量有降低趋势,不具有显著性差异。见表3。

表3 杜仲叶颗粒对OVX大鼠血清骨代谢指标的影响

3.4 对OVX大鼠股骨wnt3a、β-catenin、DKK1 mRNA表达的影响

与假手术组比较,模型组大鼠胫骨Wnt3a、β-catenin的m RNA表达显著降低,DKK1 的m RNA 表达显著升高,与模型组比较,杜仲叶颗粒组、雌二醇组均能显著升高Wnt3a、β-catenin的m RNA水平,显著降低DKK1的m RNA 表达水平。见图2。

图2 杜仲叶颗粒对去卵巢大鼠wnt3a、β-catenin、DKK1 mRNA表达量的影响

4 讨论

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以全身性骨量的丢失、骨微观结构的退行性改变为特征的骨骼疾病,根本原因在于成骨细胞和破骨细胞的动态平衡失调。ALP是指碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组糖蛋白酶,由成骨细胞分泌,ALP 增高预示着骨代谢疾病,如骨质疏松症[16]。CTX-1作为良好的骨吸收标志物,能够预测骨质疏松,前景优良[17]。本实验研究发现,杜仲叶提取物能够显著降低ALP、CTX-1水平,说明其可能是通过作用于成骨细胞和破骨细胞发挥抗OP作用。

Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路中的经典通路,既能调控成骨细胞促进骨形成,又能抑制破骨细胞分化,从而维持骨稳态[18]。Wnt/β-catenin信号通路的激活依赖于wnt蛋白与胞膜上的卷曲蛋白受体(FRZ)及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6结合,抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的表达,稳定细胞质中的β-catenin,使β-catenin在胞浆中聚积并进入细胞核,启动下游转录因子的转录和表达,从而促进骨形成[19]。

DKK1是wnt蛋白抑制剂之一,来源于骨细胞和成骨细胞,与wnt蛋白竞争性结合LRP5/6,负向调控wnt/β-catenin信号通路,抑制骨形成,使骨代谢发生异常[20]。本实验采用定量PCR 法测定Wnt3a、β-catenin和DKK1的mRNA 表达,进一步研究杜仲叶提取物抗OP 的作用机制。结果表明,杜仲叶提取物能够增加Wnt3a、β-catenin的mRNA表达,降低DKK1的m RNA 表达。进一步说明,杜仲叶的抗OP 作用是通过激活wnt/β-catenin信号通路实现的。

骨密度测量(DXA)是一种用于评估骨骼强度的临床工具,被公认为诊断骨质疏松的金标准。DXA 在评估骨折风险方面为临床医生提供了很好的服务,并且在诊断老年绝经后骨质疏松症方面尤其有用[21-22]。本实验采用DXA 对大鼠股骨骨密度进行检测,结果表明,杜仲叶提取物能够增加去卵巢大鼠的骨密度,提高骨质量。

综上所述,杜仲叶提取物对去卵巢大鼠骨质疏松具有一定的治疗作用,不仅能增加股骨骨密度,减少骨折风险,而且其机制可能与正向调控wnt/βcatenin信号通路,促进骨形成有关。