siRNA 干扰对人软骨细胞Skp2 表达的影响

袁长深，李彦宏，刘晋邑，廖书宁，梅其杰，徐文飞，段 戡

（1.广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530000）

S 期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein，Skp2）是一种癌症相关蛋白，主要位于细胞核和细胞质中，可在骨髓等组织中广泛表达（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6502#geneexpression）。Skp2 作为细胞周期的关键调节剂，可促进细胞从G1期向S 期的转换，对肿瘤的发生、发展密切相关［1，2］；甚至认为靶向Skp2 通路是癌症治疗的关键靶点［1］。然而，Skp2 在非肿瘤中，特别在骨关节炎（osteoarthritis，OA）中的作用机制仍不明确。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）可导致靶基因序列中同源双链RNA 引起一种特异性转录后的基因沉默现象［3］；RNAi 具有序列特异性、高效性、药物毒性小等特点，可参与调控细胞增殖、分化、凋亡，影响非肿瘤与肿瘤的发病［4］。RNAi 已成为基因功能研究，甚至癌症基因治疗的重要手段。目前小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术已被用于食管癌［5］、胰腺癌［6］、喉癌［7］、肺癌［8］等研究，但在OA 中的报道鲜为少见。

因此，本研究通过设计合成针对siRNA 转染人软骨细胞，观察Skp2 在人软骨细胞中蛋白表达情况及基因沉默后对人软骨细胞作用，为OA 进一步基因靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人软骨细胞完全培养基（CM-H107，普诺赛）；IL-1β（CG93，novoprotein）；FBS（10099-141，Gibco）；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent（L3000015，Invitrogen）；OPTI-MEM 培养基（31985-062，Gibco）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（T1300，Solarbio）；1×PBS（0.01 mol/L，pH7.4）（KGB5001，凯基生物）；CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒（KGA317，凯基生物）；内参：β-actin；Skp2 siRNA-318，Skp2 siRNA-504，Skp2 siRNA-59（洪博元分子实验室提供）；Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO）；超纯RNA 提取试剂盒（CW0581M，CWBIO）；HiScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR（+gDNAwiper）（R223-01，Vazyme）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711 - 02，Vazyme）；50×TAE 缓冲液（T1060，Solarbio）；6×DNA Loading Buffer（GH101-01，TRANS）；50 bp DNA Ladder（MD108，TIANGEN）；Gsafe Red plus 核酸染料（GK20002，GLPBIO）；琼脂糖粉（75510-019，Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 设计及载体构建 根据基因库Genebank 中提供人类Skp2（NM_001243120，Gene ID：6502）序列，通过https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/网站在线siRNA 设计工具设计三条siRNA。设计基因靶点是在NS 基因的第59、318、504 位点，靶点序列 分 别 是 ：Skp2 （human ）siRNA - 59 ：CAAAAAACUCAAAUUUAGUTTACUAAAU -UUGAGUUUUUUGTT ；Skp2 （human ）siRNA-318：CCAUCUAGACUUAAGUGAUTTAUCACUUAAGUCUAGAUGGTT；Skp2 （human）siRNA - 504：CCUUCAACUGUUAAAGGAATTUUCCUUUAACAGUUGAAGGTT；并设置阴性对照siRNA：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT 和空载组。与任何基因序列均无同源性，以上序列均由江西中洪博元生物技术有限公司合成。模板链两端分别设计SacⅠ和XhoⅠ酶切位点，载体构建名称：YCSWT-Skp2-Pmi-rGLO，将结合位点进行突变，将突变目的基因片段进行生物合成，与pmirGLO 载体相连，载体构建名称为YCS-UMT-Skp2-pmirGLO。使用SacⅠ和XhoⅠ双酶切突变YCS-UMT-Skp2-pmirGLO 质粒，在pmirGLO 载体上连接目的片段。将2 个多聚核苷酸片段置于37 °C 条件下酶切30 min 后，进行1%琼脂糖凝胶电泳分离得到条带。紫外灯下切下线性化的条带，应用琼脂糖DNA 回收试剂盒，回收线性化的载体并发生连接反应的体系如下：目的质粒（50 ng）1 μL，pmirGLO-F 0.5 μL，pmirGLO-R 0.5 μL，2× ES Taq Master Mix（Dye）12.5 μL，去离子水10.5 μL。连接产物分别命名为：siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504 和NC（阴性对照质粒）。

1.2.2 细胞转染 本实验分为5 组：空载组、NC 组、Skp2 siRNA-59 组、Skp2 siRNA-318 组、Skp2 siRNA-504 组。首先，在6 孔板上植入细胞，每个孔约2×105～10×105个细胞，6 cm 皿每孔约5×105～2×106个细胞。当细胞密度达到70%时，准备转染；用容量为1 mL 的无血清培养基取代细胞培养基；其次，取2 支灭菌EP 管，每支加入125 μL Opti-MEM，其中1 支加入5 μL lipofectamine 3000，另1 支加入12.5 μL siRNA 或者miRNA（siRNA 或者miRNA 干粉使用DEPC 水溶解；125 μL/1OD），混匀后室温孵育5 min；最后，将以上2 支EP 试管混匀，在室温孵育15 min 后，把混合溶液滴入6 孔板相应小孔中，将细胞移回室温孵育。当转染4～6 h 后，将1 mL 含20%血清完全培养基加到6 孔板中，在48 h 后进行后续实验。

1.2.3 RT-PCR 检测Skp2mRNA 表达水平 对人软骨细胞总RNA 进行RT-PCR 检测，根据TRIzol操作说明书进行总RNA 提取，用紫外分光光度仪从38 μL 体系的总RNA 溶液中抽取1.3 μL，在OD260和OD280下测定数据并记录。RNA 浓度和纯度分别由OD260×40=RNAng/μL 公式、1.8≤OD260/OD280≤2.2 公式计算。提取总RNA 进行琼脂糖凝胶电泳，进行RNA 跑胶，电压200 V，电流180 mA 左右，时间13 min 左右，取出凝胶，化学发光成像系统仪在显影后进行图像采集。根据HiScript Ⅱ QRT SuperMix for qPCR 逆转录试剂盒操作方法获得到单链cDNA。PCR 反应体系：2×miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，引物各0.4 μL，去DEPC 水8.2 μL 总体积20 μL。PCR 条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s；58 ℃（β-actinF、β-actinR 为58 ℃，Skp2F、Skp2R 为60.5 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳，超高灵敏度的化学发光成像系统仪所获取的影像，以β-actin为内参，引物名称及序列见表1。

表1 引物名称及序列Tab 1 Names and sequences of primers

1.2.4 细胞增殖抑制率检测 先将细胞贴壁后加药24 h，将待测96 孔板细胞用相同的培养基，每孔100 μL；并在每个孔中添加10 μLCCK8 试剂，然后放入培养箱孵化2 h，酶标仪检测450 nm 波长下各孔吸光值（IOD 值）。当细胞贴壁后加药24 h，再把待测96 孔板细胞用相同培养基，100 μL/孔培养基替换；Skp2mRNA 表达抑制率（%）计算方法为：1-siRNA 组Skp2mRNA/NC 组Skp2mRNA×100%。

1.2.5 统计学处理 运用SPSS 18.0 软件进行统计分析，组间用t检验和普通单因素方差分析比较均数，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重建质粒的酶切鉴定及测序鉴定

YCS-WT-Skp2-pmirGLO、YCS-MUT-Skp2-pmirGLO 载体通过PCR 扩增后的条带为578 bp，见图1，电泳检测结果和理论值吻合相似，测序结果和设计的DNA 片段序列完全一致，证实均为正确质粒，得到的重组干扰质粒的目的片段完全相符预期。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物条带大小Fig 1 Agarose gel electrophoresis detection of PCR products stripe size

2.2 重组质粒转染对Skp2 mRNA 表达的影响

重组质粒经转染后，siRNA-59、siRNA-318 和siRNA-504 转染组Skp2mRNA 表达明显低于NC组，具有显著性差异（P＜0.05），且以siRNA-504Skp2mRNA 表达最低；而空载组和NC 组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），siRNA 干扰后实验各组Skp2 mRNA 表达量，见表2；重组质粒转染对Skp2mRNA 表达的影响见图2。同时，进一步采用DNA 电泳对其结果进行验证，其结果与各组重组质粒转染后Skp2mRNA 结果一致。空载组、NC 组、siRNA-59 组、siRNA-318 组和siRNA-504 组表达量从左至右，分组顺序与浓度测定一致，β-actin、Skp2条带亮度正常且位置正确，为目的产物，见图3。

图2 重组质粒转染对Skp2 mRNA 表达的影响Fig 2 Effect of recombinant plasmid transfection on Skp2 mRNA expression

图3 DNA 电泳结果Fig 3 DNA electrophoresis results

表2 siRNA 干扰后实验各组Skp2 mRNA 表达量（n=3）Tab 2 Skp2 mRNA expression quantity after siRNA interference in all experimental groups（n=3）

2.3 细胞增殖抑制率检测

细胞增殖抑制率检测：采用1-siRNA 组Skp2mRNA/NC 组Skp2mRNA×100%，计算出siRNA-59 组、siRNA-318 组、siRNA-504 组的细胞增殖抑制率，结果分别为：60%、41%、64%，其中以siRNA-504 组的细胞增殖抑制率最为显著。

3 讨论

1998 年，Fire 等［9］首次发现双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）是秀丽隐杆线虫转录后基因沉默的致病因子，并将这种现象称为RNAi。RNAi 作为进化过程中高度保守的双链RNA 分子之一，可调节几乎人类所有细胞中mRNA 的稳定性和翻译［3］。在RNAi 中，有个重要的核酸内切酶Dicer，它可与双链RNA 分子结合，并从dsRNA 钝头或3 端有小悬突的dsRNA 上进行切割，将其剪切成2l-23nt 长及3'端突出的片段，即siRNA［10］。siRNA 对核苷酸序列具有高度特异性，可有效地对特定基因进行RNAi 沉默［3］，这是因为siRNA 在细胞内被依附于RNA 的RNA 聚合酶1、2、6 进一步扩增，并以单链的形式与AGO1 蛋白结合，从而形成由RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），引导部分或完全互补的mRNA 与其相互作用，导致特异的mRNA 被降解，产生转录后水平基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［11］。PTGS 存在于自然生物细胞中，是细胞抵抗外来核酸入侵，并维持自身基因组完整性的一种防御手段［12］；PTGS 能将特异性同源双链RNA 导入细胞内，使靶点基因不表达或者表达水平下降。因此，RNAi 也作为一种简单有效的代替基因敲除的方法［11］。随着RNAi 技术的不断发展，由于其具有高稳定性、高特异性及高效性等特点，已在基因功能及肿瘤治疗方面被广泛运用［13］，但在OA 领域则较为少见。所以，RNAi 的发现和应用为生物医学研究提供一个独特且适应性强的工具，成为发展生命科学和药物研发的重要方向［14］。RNAi 也有望成为治疗OA 的一种有效方法，为防治OA 开辟新的途径。

Skp2作为Skp1-Cullin-F-box（SCF 复合体）E3连接酶中的一种F-box 蛋白，可通过泛素介导G1 检查点CDK 抑制剂-p21 和p27、p57 和叉头转录因子1降解来靶向细胞周期进程。由于Skp2具有调控细胞周期的作用［4］，所以其表达水平影响肿瘤发生、发展、预后等［2，15-17］。目前Skp2在肿瘤领域研究较多，但在OA 的研究甚少。Wang 等［18］通过对GSE48556、GSE46750、GSE32317 数据集综合荟萃分析发现，Skp2存在于OA 中；且认为高糖状态下Skp2过表达可促进软骨细胞增殖［19］。同时，研究发现在营养丰富的条件下，Skp2的SCFE3 泛素连接酶可维持细胞核中精氨酸甲基转移酶共激活因子1（CARM1）稳定性［20］；而在饥饿状态下，Skp2则会激活细胞核中的AMP 依赖蛋白激酶（AMPK），激活的AMPK使叉头转录因子O3 磷酸化，导致Skp2下调并增加细胞核中CARM1 蛋白水平；稳定的CARM1 作为转录因子EB 必要激活因子，进而调控细胞自噬和溶酶体基因的表达。由于Skp2在AMPK-Skp2 -CARM1 信号轴中发挥关键介质作用［21］，所以Skp2被认为是自噬相关疾病潜在治疗靶点［19］。生信预测发现Skp2是OA 的关键基因［18］，而自噬能够清除受损和功能失调的细胞器和大分子，保持OA 软骨内环境的稳态［22］，因而推断Skp2可能在OA 自噬中发挥重要作用。因此，观察Skp2在人软骨细胞中的表达情况，为研究Skp2在OA 中的靶向治疗提供依据。

本实验通过使用在线siRNA 设计工具，利用Skp2 序列作为靶位点，设计三条序列，采用基因重组技术，成功体外构建Skp2siRNA 表达载体，然后转染到人软骨细胞。结果发现，siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504 转染组Skp2mRNA 表达明显低于NC 组，具有显著性差异（P＜0.05）；进一步采用DNA 电泳对其结果进行验证，其结果与各组重组质粒转染后Skp2mRNA 结果一致。进而观察对Skp2mRNA 表达抑制率，实验显示Skp2mRNA 在siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504 中的抑制率分别为60%、41%、64%，其中以siRNA-504 转染组抑制率最高。针对Skp2的siRNA，能有效降低Skp2mRNA 表达，产生基因沉默效应，提示Skp2可能成为OA 治疗的一个靶基因，而Skp2第504 位点可能是研究其重要靶点。

本研究通过构建载体，成功介导siRNA 对人软骨细胞Skp2表达的抑制作用，表明在OA 基因治疗领域中具有可行性。随着siRNA 技术的日臻完善，该技术可能成为OA 基因治疗的重要组成部分。

作者贡献度说明：

袁长深：文章撰写，文章后期审校；李彦宏、刘晋邑、廖书宁、徐文飞：文章内容修改；段戡：文章设计。梅其杰：文章评估。

所有作者声明不存在利益冲突关系。