黄芪石斛方对小鼠免疫功能的影响

扈觐玺 刘佳琪 邵紫萱 李丽 冯颖童 刘双巧 贾岚 王景霞

当代社会竞争日趋激烈,工作生活压力增大,精神紧张,作息不规律等诸多因素,导致部分人群处于免疫力低下的亚健康状态[1],而增强免疫力类保健食品是一种安全增强免疫力,改善亚健康状态的有效措施。黄芪石斛方是在中医辨证保健理论[2]指导下,基于未病先防的思想,针对免疫功能低下人群属脾肾亏虚者而设,选择具有健脾补肾,益气养阴功效的黄芪、女贞子、西洋参、铁皮石斛配伍而成。本研究按照《保健食品检验与评价技术规范》[3]评价黄芪石斛方增强免疫力的保健功能,探讨“健脾补肾,益气养阴法”与增强免疫力的关系,为黄芪石斛方精准应用于免疫力低下人群,降低患病风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

80只SPF级雄性昆明小鼠,体质量18～22 g,购自北京斯贝福生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010。动物饲养于北京中医药大学动物实验室的屏障环境中,室温为(24±2)℃,空气相对湿度为(60±10)%,光照12小时/天,自由饮水。动物伦理审批号:BUCM-4-2019110201-4032。

1.2 实验药物

黄芪(批号:200602CP273)购自河北万修药业有限公司;女贞子(批号:201201)、西洋参(批号:201101)购自珠海市健兴药业有限公司;铁皮石斛(批号:20201201)购自云南天泉生物科技股份有限公司。制备:由北京中医药大学中医临床药学实验室制备,按3∶3∶2∶3比例称取黄芪、女贞子、西洋参、铁皮石斛,经水提、浓缩、干燥、粉碎等工艺制得干膏粉,作为受试物。

1.3 主要试剂

刀豆蛋白A(Sigma,批号:L6397)、MTT(阿拉丁,批号:D274386)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(阿拉丁,批号:D103272)、乳酸脱氢酶(Sigma,批号:L1254)、PMS(Sigma,批号:P9625)、氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(Sigma,批号:P9625)、Tris(阿拉丁,批号:T105289)、NH4Cl(阿拉丁,批号:A116370)、血清溶血素水平(serum hemolysin level,HC50)试剂盒(华英生物,批号:20220725)、免疫球蛋白A(华英生物,批号:20220915)、免疫球蛋白G(华英生物,批号:20220915)、免疫球蛋白M(华英生物,批号:20220915)、补体C3(华英生物,批号:20220915)、补体C4(华英生物,批号:20220915)、肿瘤坏死因子α(华英生物,批号:20220910)、γ干扰素(华英生物,批号:20220910)、白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)(华英生物,批号:20220910)、绵羊红细胞(华英生物,批号:20220915)、正常豚鼠血清(华英生物,批号:20220915)、都氏试剂(海标科技,批号:20220805H)。

1.4 主要仪器

电子天平(FA1004,上海力辰邦西仪器科技有限公司)、CO2培养箱(QP50,山东博科)、酶标分析仪(DR-200BS,华卫德朗)、数显游标卡尺(精密度0.02 mm,ASOne)、微量注射器(50 μL,sigma-aldrich)、移液器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL ,Eppendorf)、HT7700型透射电子显微镜(TEM,日本日立公司)、neofuge 15R型冷冻离心机(heal force公司)。

1.5 实验分组及给药方法

80只小鼠随机均分为A、B两批,设小鼠迟发型变态反应、脾淋巴细胞转化实验、抗体生成细胞检测实验、血清溶血素测定实验、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)活性测定、血清免疫球蛋白含量和补体含量测定7个试验,A批进行迟发型变态反应、抗体生成细胞检测实验、血清溶血素测定实验,B批进行脾淋巴细胞转化、NK细胞活性测定以及血清免疫球蛋白含量和补体含量测定。两批小鼠适应性饲养7天后,每批根据随机数字表法分为4组即空白对照组、黄芪石斛方低(1.833 g/kg)、中(3.667 g/kg)、高剂量(5.5 g/kg)组(以生药量计,每日灌胃剂量为人体用量10、20、30倍),每组10只。空白对照组小鼠灌胃等体积的蒸馏水,各剂量组小鼠灌胃相应的黄芪石斛方溶液,灌胃量为0.1 mL/10g 体质量,连续给药30天。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 胸腺指数与脾指数 称取小鼠体质量、脾脏重量、胸腺重量,计算脾指数与胸腺指数。脾指数=脾脏重量/体质量;胸腺指数=胸腺重量/体质量。

1.6.2 迟发型变态反应实验 小鼠于给药第25天腹腔注射2%(v/v)绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC)进行免疫。免疫4天后,使用数显游标卡尺测量左后足跖厚度并在测量部位注射20%(v/v)SRBC,于24小时后测量左后足跖部厚度,两次测量均为同一部位测量三次,取平均值。结果以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值表示。

1.6.3 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法) 小鼠于给药第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC进行免疫。5天后将小鼠颈椎脱臼处死,取出脾脏磨碎制成细胞悬液,调整细胞浓度为5×106/mL,与加入Hanks液的表层培养基(1 g琼脂糖加双蒸水至100 mL)混合均匀倾倒于刷琼脂糖薄层的玻片上放入二氧化碳箱中孵育1～1.5小时,然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内,继续温育1～1.5小时后,计数溶血空斑数。

1.6.4 血清溶血素测定 小鼠于给药第25天腹腔注射2%(v/v)SRBC进行免疫,5天后取血分离血清,设样品孔和空白对照孔,样品孔:取血清用SA缓冲液稀释后依次加入SRBC,补体(用SA溶液按1∶8稀释)。空白对照孔:除不加入血清外同样品孔。置37°C恒温培养箱中保温30分钟后,冰浴终止反应。水平离心10分钟后分别取样品孔和空白孔上清液加入另一个96孔板内加入都氏试剂。同时设半数溶血孔[加入10%(v/v)SRBC再加入都氏试剂]。用震荡器充分混匀,放置10分钟后,于540 nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。溶血素的量以HC50表示,按下列公式计算。

1.6.5 ConA诱导脾淋巴细胞转化实验(MTT法) 小鼠于给药第30天颈椎脱臼处死。无菌取脾,制备脾细胞悬液。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,一孔加ConA液另一孔作为对照,置5%CO2,37℃CO2孵箱中培养72小时。培养结束前4小时,每孔吸去上清液,加入不含小牛血清的RPM1640培养液,同时每孔加入MTT继续培养4小时。培养结束后,每孔加入酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。随后分装至96孔板中,每孔作3个平行孔,于540 nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。

1.6.6 NK细胞活性实验 小鼠于给药第30天颈椎脱臼处死。无菌取脾,制备脾细胞悬液。取靶细胞和效应细胞加入U型96孔板中,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液,靶细胞最大释放孔加2.5%Triton,上述各项均设三个平行孔于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时,然后将96孔培养板离心并每孔吸取上清液置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液反应5分钟,每孔加入1 mol/L的盐酸溶液30 μL,在酶标仪490 nm处测定光密度值。并按照下式计算NK细胞活性。

1.6.7 血清生化指标测定 小鼠于给药结束后,眼眶取血,室温放置1小时,4°C 3000 r/min离心15分钟分离血清备用。采用比色法检测血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量,免疫比浊法检测血清中补体C3、C4含量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 黄芪石斛方对动物脏器/体质量比值的影响

与空白对照组比较,黄芪石斛方各剂量组小鼠胸腺脏器指数与脾脏器指数差异无统计学意义(P>0.05),结果见表1。

表1 黄芪石斛方对小鼠胸腺指数和脾指数的影响

2.2 黄芪石斛方对SRBC诱导小鼠足跖厚度差值和抗体生成细胞的影响

与空白对照组比较,黄芪石斛方低、高剂量组足跖厚度差值显著升高(P<0.05,P<0.01),低、中、高剂量组溶血空斑数均显著升高(P<0.05,P<0.01)。见表2、3。

表2 黄芪石斛方对SRBC诱导小鼠足跖厚度的影响[M(P25,P75),mm]

表3 黄芪石斛方对SRBC诱导小鼠抗体生成细胞的影响

2.3 黄芪石斛方对SRBC免疫小鼠血清溶血素水平、脾淋巴细胞增殖、NK细胞活性的影响

与空白对照组比较,黄芪石斛方中、高剂量组血清溶血素水平均显著升高(P<0.05,P<0.01),低、中、高剂量组脾淋巴细胞转化值显著升高(P<0.01),NK细胞活性显著升高(P<0.01)。见表4。

表4 黄芪石斛方对SRBC免疫小鼠血清溶血素、淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性的影响

2.4 黄芪石斛方对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响

与空白对照组比较,黄芪石斛方低、中、高剂量组血清IgG、IgM、IgA含量均显著升高(P<0.01),结果见表5。

表5 黄芪石斛方对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响

2.5 黄芪石斛方对小鼠血清补体含量的影响

与空白对照组比较,黄芪石斛方低、中、高剂量组血清C3、C4含量均显著升高(P<0.05,P<0.01),结果见表6。

表6 黄芪石斛方对小鼠血清补体含量的影响

3 讨论

免疫力是免疫系统抵抗疾病的能力,人体具有一套完整的免疫防护系统如胸腺、脾脏、淋巴结、淋巴组织等[4],以及执行免疫功能的免疫活性细胞如T细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等[5],这些免疫活性细胞在神经、体液及免疫系统的自身调节下,相互协调,执行自己的职能,以保证人体处于一个自身稳定的正常状态。若免疫功能受损,机体免疫力下降,则不能正常发挥免疫功能,对细菌、病毒等病原微生物的抵抗能力降低从而容易罹患感冒、肝炎、结核等感染性疾病。

现代医学免疫力的概念与中医理论所述的“正气”相似,正气是相对邪气的称谓,泛指人体正常的生命物质及其功能活动,以及基于此而产生的各种维护能力,包括自我调节、适应环境、抗病祛邪和康复自愈等能力,是人体生理功能状况的总称[6]。中医学认为“正气存内,邪不可干”,正气是人体感邪后发病与否,疾病转归、预后好坏的关键。正气的旺盛依赖于正常的脏腑生理功能和充沛的气血津液以及精微物质。若脏腑功能正常,气血充盈,阴阳平衡,则外邪难以入侵,疾病就无从发生。因此,中医主要通过调节脏腑功能,补益气血,来维持机体内在的阴阳平衡,从而达到提高免疫力的作用。

《金匮要略》提出扶正祛邪以调补脾肾为主,五脏中首重脾肾。肾为先天之本[7],正气之根,所以肾为免疫的生化之源,肾气足,肾精充,方可正气旺,免疫强,不仅少受邪气侵袭,还可祛邪于外。脾胃为后天之本[8],气血生化之源,所以脾为免疫的物质基础。脾气健旺,运化有度,免疫活性物质正常产生,机体免疫功能运作正常,反之脾气虚则导致免疫功能低下[9]。脾肾相互资生,相互促进,即“先天促后天,后天滋先天”,健脾补肾对于调节免疫功能平衡至关重要。在现代医学中根据免疫器官功能不同,分为中枢免疫器官和外周免疫器官,两者通过血液循环和淋巴循环互相联系。其中中枢免疫器官包括骨髓和胸腺,外周免疫器官包括淋巴结与脾脏[10]。《黄帝内经》中指出“肾主骨生髓”[11],中医理论认为骨髓功能的正常与否和肾精气充盛与否相关联,所以中医理论中的补肾健脾与现代医学中增强中枢和外周免疫器官功能思路相得益彰。

黄芪石斛方由黄芪、西洋参、铁皮石斛、女贞子四味中药组成,其中黄芪甘微温,入脾经,能补气健脾,生津养血,滋养后天之本,使气血生化有源以不断充养先天;西洋参甘苦凉,归肾经,能大补元气,补气养阴,清热生津;石斛甘寒,归胃、肾经,能益胃生津,滋阴清热;女贞子甘苦凉,归肝、肾经,药性和缓而持久,功善滋补肝肾,清退虚热,补中有清,为一味清补之品。诸品合用,共奏健脾补肾,益气养阴之功,且补中有清,滋而不腻,无温燥上火之弊端。现代研究显示,黄芪[12-13]、西洋参[14-15]、铁皮石斛[16]、女贞子[17-18]均具有增强机体免疫力的作用。且黄芪和女贞子配伍可以显著提高环磷酰胺造成的免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能,同时可以提高小鼠血清溶血素抗体水平及增强二硝基氯苯所致迟发型超敏反应[19]。国家市场监督管理总局查询数据显示,截至2023年2月,153项已批含铁皮石斛的保健食品中有62项包含铁皮石斛和西洋参配伍,徐建华[20]通过对小鼠和家兔的研究证明铁皮石斛与西洋参单用及合用均具有养阴生津的功效,同时发现两药合用时有协同作用。杨明晶[21]研究发现铁皮石斛和西洋参配伍可有效促进小鼠淋巴细胞增殖能力,提高产生抗体细胞和血清溶血素的功能,增强其NK细胞活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力。这些研究也为黄芪石斛方用于增强机体的免疫力提供了理论依据。

B淋巴细胞受到抗原刺激后会增殖分化出大量浆细胞,浆细胞可合成和分泌多种免疫球蛋白,免疫球蛋白是机体体液免疫重要组成部分。IgG、IgM、IgA属于免疫球蛋白中最重要的几种类型。其量的变化可以一定程度反映B淋巴细胞功能进而反映机体体液免疫功能[22]。补体C3是补体系统的核心[23]为补体系统经典激活与替代激活途径过程的关键成分。补体C4是经典途径中第二个被激活的补体分子,其被活化后裂解成的C4b片段主要参与经典途径中C3转化酶和C5转化酶的形成,介导补体后续成分的级联反应[24],在30多种补体蛋白中,补体C3、C4与补体总水平趋势一致,可反映补体系统的状态,继而反映机体免疫功能状态[25]。本实验中IgG、IgM、IgA、C3、C4水平均有不同程度的升高,说明黄芪石斛方可能通过调节B淋巴细胞分泌和补体系统来增强机体免疫功能。