天冬氨酸酶体系中R-3-氨基丁酸相关物质HPLC 方法研究

穆玉敏，韩广欣，张浩月，梁海龙，杨梦茜，刘丽荣，任丽梅,2,3

（1.石家庄学院化工学院，河北 石家庄 050035；2.河北省生物制药国际联合研究中心，河北 石家庄 050035；3.河北省高效微生物制药应用技术研发中心，河北 石家庄 050035；4.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家庄 050000）

0 引 言

R-3-氨基丁酸是医药中间体R-3- 氨基丁醇的前体。R-3-氨基丁醇则是合成抗艾滋病整合酶抑制剂杜鲁特韦的重要原料。R-3-氨基丁酸还可以衍生为β-内酰胺，进而合成青霉烯类抗生素。

杜鲁特韦(Dolutegravir)作为葛兰素史克旗下抗HIV 新药，2013 年获批FDA 上市并承认了它的突破性。降低杜鲁特韦原料药成本、推广其应用范围的关键步骤是R-3-氨基丁酸。

据统计，2016 年全球抗HIV 药物销售额为230.23 亿美元，2011～2016 年复合增速为8.4%，显著高于全球药物市场约3.5%的平均增长率。到2022 年市场价值增长到320 亿美元，R-3-氨基丁酸作为其重要原料中间体，其市场容量及价格也是水涨船高。

R-3-氨基丁酸为一种手性氨基醇类，早期的氨基醇类物质主要通过天然的氨基酸为原料还原得到。目前，合成R-3-氨基丁醇的方法有以硼氢化物还原法、以酒石酸为拆分剂的拆分法和以钌碳等为诱导剂的化学诱导法等，近年兴起以各种酶为核心的生物催化和基因转移等合成方法。采用以上方法制备R-3-氨基丁醇的环境有不能直接获得手性产物、污染大、收率不高且不利于企业的节能减排等缺点，生物法的相关产品研究逐步走向市场。为了降低杜鲁特韦原料药成本，推广R-3-氨基丁醇应用范围，重要步骤在于开发一种高效、低成本的路线合成高纯度的R-3-氨基丁酸。

随着科学研究进步，发现利用天冬氨酸酶突变体可以提供一种催化反式丁烯酸生产R-3-氨基丁酸的新路线。优化其生产工艺达到工业化生产，对于生物医药行业具有重要的意义。该酶促体系由巴豆酸、铵盐、含镁离子的盐组成，重组天冬氨酸酶突变体为生物酶催化剂，以氨水调节pH，在特定温度及碱性条件下进行反应，然后经过分离、纯化、脱色、过滤、结晶、干燥，获得R-3-氨基丁酸。相对以上提及的化学法，生物催化具有环境友好、条件温和、收率高、易制备和工艺路线短等优点，可为杜鲁特韦重要原料R-3-氨基丁醇的工业化生产提供可靠的技术支撑。除此之外，与传统的化学合成相比，微生物合成技术是通过环境友好的途径制备，免于使用重金属、有机溶剂以及强酸强碱，且生物催化剂具有高效的底物特异性，可减少副产物的形成。R-3-氨基丁酸是一种典型的手性β 氨基酸，据研究发现其有效组分仅为R 构型。

本论文根据生物酶催化的高选择性，针对生物催化结束后的反应液以及终成品获得前成分复杂的母液等进行分析方法探讨。生物酶催化原理：巴豆酸加铵盐经天冬氨酸酶催化，催化条件42 ℃pH 9.0，200 rpm 得到R-3-氨基丁酸。反应液及母液等纯化步骤为：催化反应液—离心过滤—超滤—脱色（活性炭） —脱炭—减压浓缩—结晶—离心洗涤—干燥—成品包装。由生物酶催化原理和反应液及母液等纯化步骤可知，该反应中间步骤包含铵根离子、镁离子、原辅料杂质、反应杂质等复杂组分。目前国内外关于R-3-氨基丁酸含量测定方法主要为滴定法：精密称定R-3-氨基丁酸标准品0.1 g 到250 mL 三角瓶中，加3 mL 无水甲酸待样品完全溶解后继续加入50 mL 冰醋酸，然后加两滴结晶紫指示剂，立刻用高氯酸（已标定） 滴定至紫色消失变为蓝色，保持30 s 不变色。R-3-氨基丁酸含量测定方法衍生法：采用1-氟-2,4-二硝基苯和HPLC 进行衍生化，在360 nm 处进行紫外检测。R-3-氨基丁酸的相关物质检测高效液相法：流动相：准确量取纯水990 mL，甲醇10 mL 加入1 000 mL 量筒，加入0.5 mL 磷酸和1 mL 三乙胺调pH 为5.6，过滤超声15 min 即得。稀释液：超纯水，色谱条件：色谱柱：YMC - Pack Pro C18 150×4.6 mml.D.S-3 μm；210 nm；流速：0.5 mL.min；波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；运行时间：30 min。上述3 种方法实验步骤繁琐，且需结合不同方法定量检测R-3-氨基丁酸及其相关物质巴豆酸等，为解决现有方法存在的问题，本文开发了一种能够快速、准确定量检测R-3-氨基丁酸及其相关物质的高效液相色谱分析方法。通过50 mL 小体系反应及1 L、30 L 体积放大反应验证，在该方法条件下反应底物巴豆酸在浓度0.05~0.4 g/L 范围内线性良好，R2＞3 个9，产物R-3-氨基丁酸在浓度0.35~2 g/L 范围内线性良好，R2＞3 个9，此方法同时满足监测催化反应过程、原辅料及成品杂质监测，效率大大提升，该检测法灵敏度高，检测限为0.2 g/L，定量限0.5 g/L，对获取高纯度R-3-氨基丁酸有重大贡献。

1 结果与讨论

1.1 实验部分

1.1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪，LC-2030 Plus 岛津。

电子天平，赛多利斯仪器有限公司型号AUW 220D。

pH 计，梅特勒- 托利多仪器有限公司，Seven2 Go S2。

1.1.2 材料与试剂

磷酸二氢钾，分析纯。

乙腈，色谱纯。

磷酸阿拉丁色谱纯含量≥85%。

超纯水。

甲醇康科德，色谱纯。

三乙胺色谱纯含量≥99.5%。

R-3-氨基丁酸标样麦克林含量≥99.5%。

巴豆酸标样阿拉丁含量≥98%。

1.2 实验方法

1.2.1 流动相制备

流动相一：准确量取纯水990 mL，甲醇10 mL加入1 000 mL 量筒，加入0.5 mL 磷酸和1 mL 三乙胺调pH 为5.6，过滤超声15 min。

流动相二：30 mM 磷酸二氢钾加入超纯水超声至完全溶解，加5%乙腈，用磷酸调pH 为2.5，用0.45μm 有机膜过滤后超声15 min。

1.2.2 标准溶液的制备

质量浓度为10 mg/mL 的标准溶液配置：精准称量0.1 g（精确至0.000 1 g） R-3-氨基丁酸标准品，用超纯水溶解后定容至10 mL，震荡混匀。分别吸取0.5、1、1.5 和2 mL 至10 mL 容量瓶，稀释成0.5、1.0、1.5 和2.0 mg.mL-1的标准溶液，备用。质量浓度为10 mg/mL的标准溶液的配置：准确称取0.1 g（精确至0.000 1 g） 巴豆酸标准品，用超纯水经超声波溶解后并定容至10 mL，振荡混匀，用超纯水按上述步骤将10 mg/mL的标准溶液逐级稀释成0.05、1.0、2.0 和4.0 mg/mL的标准溶液，备用。

1.2.3 高效液相色谱分析条件

分析条件1：色谱柱:YMC - Pack Pro C18 150×4.6 mml.D.S-3 μm；流速：0.5 mL/min；波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；运行时间：30 min。

分析条件2：安捷伦Analytical 4.6×250 mm 5-Micron ；流速：1.0 mL/min；波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；采集时间：20 min。色谱操作条件为典型操作参数，依据仪器特点，可对操作参数进行适当调整，以获得最佳效果。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

分别用流动相一、二对应分析条件1、2，进液相检测R-3-氨基丁酸成品得到R-3-氨基丁酸及相关物质色谱。色谱条件2 R-3-氨基丁酸如图1 所示。

图1 色谱条件2 R-3-氨基丁酸Fig.1 Chromatography condition 2 R-3-aminobutyric acid.

色谱条件1 R-3-氨基丁酸如图2 所示。

图2 色谱条件1 R-3-氨基丁酸Fig.2 Chromatography condition 1 R-3-aminobutyric acid

由图1 和图2 可以看出，两个色谱条件检测同一样品R-3-氨基丁酸可得出结论。

（1） 液相色谱条件二基线相较平稳。

（2） 液相色谱条件二灵敏度更高，可检测其相关物质更低检出限，有利于工艺控制得到纯度更高的产品。

（3） 液相色谱条件二相对时间较短，可提高检测效率。

综上特点色谱条件二可以同时完成原辅料、催化反应、纯化结晶和成品含量及杂质分析，高效便捷。

2.2 检出限和定量限及方法线性相关性的测定

分别以3 倍和10 倍信噪比浓度得到检测限（LOD） 和定量限（LOQ），LOD 为0.15 mg/mL，LOQ 为0.5 mg/mL。配制R-3- 氨基丁酸和巴豆酸不同质量浓度标准溶液4 个，在液相色谱条件二下， 分别进行分析检测，用质量浓度做横坐标，以峰面积为纵坐标得到线性回归方程。线性关系测试结果见表1。

表1 线性关系测试结果Table 1 Result of linear relationship test

如表1 在液相色谱条件二体系中，该反应底物巴豆酸在浓度0.05~0.4 g/L 范围线性良好，R2＞3个9，产物R-3-氨基丁酸在浓度0.35-2 g/L 范围线性良好，R2＞3 个9，该液相色谱条件可满足催化反应至结晶过程含量及杂质监测，方便快捷。

2.3 方法精密度的测定

对同一样品重复6 次，在液相色谱条件二体系中检测，精密度测试结果见表2。

表2 精密度测试结果Table 2 Result of the precision test

准偏差为8.9%；杂质标准偏差为5.0%；巴豆酸标准偏差为1.4%；该液相色谱条件对各个重要物质均能达到精密测定，重现性好。

3 展 望

R-3-氨基丁酸是抗艾滋病药物杜鲁特韦的重要原料，市场需求量与日俱增，本文主要对天冬氨酸酶生物催化反应体系有关物质开展了一些研究，该工艺条件温和、环境友好、工艺路线短、收率高、易制备、选择性高，但该方法蛋白含量大，尤其全菌体系表现出更强的活性，碍于时间受限，不完善之处，从以下几个方面继续探究。

（1） R-3-氨基丁酸UV 响应值较低，检出限相对较高，线性范围较窄，巴豆酸UV 响应值较高，线性范围宽，合理稀释倍数尤为重要。

（2） R-3-氨基丁酸与S-3-氨基丁酸形影不离，仅R-3-氨基丁酸为有意义活性，化工等其余领域是否直接高效生成R 构型无法确定，本方法是否适用其体系有待研究。

（3） 本文涉及催化反应底物较少蛋白较高体系，检测前必需对样品进行高温灭活及离心去除蛋白处理，用0.22μm 有机滤膜过滤上机检测，添加预柱以适当保护色谱柱，需进一步优化上机检测前处理手段。

4 结 语

上述实验结果表明，采用本方法可满足生物转化法体系R-3-氨基丁酸原辅料、催化反应、纯化结晶、成品含量同时检测R-3-氨基丁酸及其有关物质检测，线性回归方程符合标准，基线平稳、分离效果好、准确度和精密度高、操作简单、快捷，是一种较为理想的HPLC 分析方法。

本文借助于生物转化法高选择性优点，生成高纯度R-3-氨基丁酸技术日益成熟，本方法成本大大降低，且顺应我国环保发展趋势，推广此分析方法极具必要性。

本文方法已同时以实验级试剂和工业级试剂，在不同发酵体系和摇瓶催化及公斤级催化实验验证，在成品检测中更体现出其有关物质检出限更低的优势，从而得到含量更高，纯度更高成品。