食蟹猴纹状体内注射α-突触核蛋白预制原纤维对嗅球病理改变的影响

丁雨潇，粟璟曦，宋琼，王丽惠，吴日宝，况昕宇，苏迎，邹春林，2△

帕金森病（Parkinson，PD）又名震颤性麻痹，是一种多发于老年人群的神经退行性疾病，在65岁以上老年人群中患病率达2%～3%，受到人口老龄化及环境等因素影响，预计到2040年全球患病人数将达到1 420万［1］。目前临床上对于PD患者的诊断大多依赖于静止性震颤、行动迟缓、肌强直等运动症状，但当患者被诊断为PD 时，黑质致密部的多巴胺（Dopamine，DA）能神经元约有一半已经丢失。然而嗅觉功能障碍作为PD早期常见的非运动症状，通常先于运动症状数年发生，对于辅助PD患者尽早诊断具有重要意义［2］。α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）是一种神经元特异性突触前膜蛋白，也是PD特征性包涵体——Lewy 小体的重要成分。α-Syn 与PD发病过程密切相关［3］。为了研究病理性α-Syn的致病机制，研究人员在体外合成了与病理性α-Syn原纤维结构高度相似的α-Syn 预制原纤维（α-Synuclein Preformed Fibrils，α-Syn PFF），并将其应用于PD 细胞和动物模型的制作［4］。与传统的神经毒素诱导的PD 模型相比，α-Syn PFF 诱导的PD 模型可以更好地模拟PD 患者的病理特征，如在黑质DA能神经元内可见病理性α-Syn 聚集和Lewy 小体样包涵体的形成。但是目前关于α-Syn PFF 诱导的PD动物模型的研究常见于小鼠［5］，在非人灵长类动物上较少见，并且对模型动物脑组织病理改变的研究主要集中于黑质和纹状体等脑区［6］，对嗅球损伤的研究较少。本实验于食蟹猴双侧纹状体注射α-Syn PFF构建模型，探讨食蟹猴纹状体内注射α-Syn PFF对嗅球病理改变的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 5 只正常雌性食蟹猴（8～11 岁）购自广西雄森灵长类实验动物养殖开发有限公司，动物生产许可证号：SCXK（桂）2016-0003，并饲养于广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司的非人灵长类实验室，动物使用许可证号：SYXK（桂）2019-0002。该实验室已通过国际实验动物评估和认可管理委员会（AAALAC）认证，动物房饲养温度保持23～27 ℃，光照黑暗各12 h 循环交替，纯净饮用水持续供应，每日供给常规饲料和新鲜水果。所有涉及动物的实验方案均得到了动物关怀与使用伦理委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）的批准（伦理号：W00154）。

1.1.2 主要试剂及仪器 鼠源酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）单克隆抗体（MAB318）购自美国Millipore 公司；兔源磷酸化α-Syn（pS129）单克隆抗体（ab51253）、兔源双皮质素（Doublecortin，DCX）多克隆抗体（ab18723）购自英国Abcam公司；生物素化山羊抗兔二抗（BA-1000）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素工作液（SA-5004-1）、DAB 过氧化物酶底物试剂盒（含镍，SK-4100）购自美国Vector公司；DAB 显色试剂盒（ZLI-9018）、小鼠SPN 试剂盒（SPN-9002）、兔SPN 试剂盒（SPN-9001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；尼氏染色液（C0117）购自上海碧云天生物技术有限公司。Leica冰冻切片机（LEICA CM1950）购自德国Leica公司。

1.2 模型建立 根据食蟹猴脑部磁共振影像，对3只食蟹猴施以脑立体定向注射手术，将300 µg α-Syn PFF（7 g/L）注射到双侧纹状体的6个位点，即每侧纹状体壳核头部注射60µg，体部注射60µg，尾部注射30µg。另2 只食蟹猴于相同部位给予同等剂量磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照组。观察2年，于注射2年后，分别对5只食蟹猴静脉注射过量的戊巴比妥钠行安乐死，经左心室以生理盐水灌流冲洗血管，开颅取出嗅球，并经4%多聚甲醛固定后，分别在10%、20%和30%蔗糖中梯度脱水，OCT包埋并切成14µm厚的冰冻切片。

1.3 免疫组织化学染色 冰冻切片经烤片30 min，4%多聚甲醛固定30 min，0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液微波修复抗原，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶30 min，0.3%Triton X-100 增加细胞通透性30 min，5%羊血清封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，包括TH 抗体（1∶400）、DCX 抗体（1∶4 000）、pS129 抗体（1∶1 000），次日以0.1 mol/L 磷酸缓冲液（PB）冲洗3次，孵育生物素化山羊抗小鼠或抗兔二抗90 min，0.1 mol/L PB 冲洗3次，之后孵育HRP 标记链霉卵白素工作液或HRP 标记链霉亲和素工作液（1∶250）反应90 min，0.1 mol/L PB 冲洗3 次，DAB显色或含镍DAB底物液显色，镜下控制显色时间，蒸馏水清洗2次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。由于嗅球不同切面的切片细胞数量可能差异较大，为避免由于集中选取某一部分的切片导致细胞数的差异在对照组和实验组每只食蟹猴嗅球切片中每间隔5 张挑取1 张，每只食蟹猴共选取5张切片，每张切片均匀地选择5个20倍镜下视野，利用Image J软件计数DA和DCX阳性细胞数。

1.4 尼氏染色 切片浸入4%多聚甲醛固定20 min，蒸馏水洗涤2 min，重复1 次，之后在组织上滴加尼氏染液，放入37 ℃孵箱中染色10 min，取出后蒸馏水洗涤2 次，浸入95%乙醇分色约5 s，最后于95%乙醇中脱水2 min，重复1 次，二甲苯透明5 min，重复1次，中性树胶封片。

1.5 统计学方法 用SPSS 23.0 软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 嗅球组织病理改变 对照组整体着色较深，颗粒细胞层（granule cell layer，GCL）与僧帽细胞层（mitral cell layer，MCL）神经元多且排列紧密，细胞轮廓清晰；实验组整体着色较淡，GCL 与MCL 神经元数量明显减少，MCL 排列松散，且细胞轮廓模糊，见图1。

2.2 病理性α-Syn 可传播至嗅球 对照组嗅球中无pS129阳性反应，实验组嗅球存在大量pS129阳性聚集体，见图2。

Fig.2 Immunohistochemistry staining of pS129 in olfactory bulb图2 免疫组织化学染色嗅球组织pS129表达

2.3 α-Syn PFF 诱导嗅球DA 能神经元丢失 与对照组相比，实验组嗅球DA 能神经元数量明显减少。实验组TH阳性神经元数量为（27.00±11.22）个，对照组为（65.80±36.54）个，差异有统计学意义（t=3.257，P＜0.01），见图3。

Fig.3 The number of TH-positive neurons detected by immunohistochemistry staining in olfactory bulb图3 免疫组织化学染色检测嗅球TH阳性神经元数量

2.4 α-Syn PFF抑制新生神经元生成 与对照组嗅球DCX阳性神经元数量［（88.30±19.89）个］比较，实验组［（67.60±17.23）个］明显减少，差异有统计学意义（t=2.678，P＜0.05），见图4。

Fig.4 The number of DCX-positive new neurons detected by immunohistochemistry staining in olfactory bulb图4 免疫组织化学染色检测嗅球DCX阳性新生神经元数量

3 讨论

3.1 食蟹猴纹状体注射α-Syn PFF 模型更具代表性 PD患病人数逐年上升，已经造成严重的社会医疗负担。目前虽然已经开发了多种动物模型来研究该疾病，但每种模型都有一定的局限性［7］。以毒素为基础的动物模型［8］主要针对PD的运动症状，极大地促进了其对症治疗的发展，这些模型的优点是运动症状表型清晰，建模时间短，可以应用于多种动物，但实验过程中难以避免实验者暴露，且对于脑内病理改变的再现效果较差。α-突触核蛋白基因（SNCA）是编码α-Syn的基因，也是家族性帕金森病重要的致病基因，基于SNCA基因突变构造了许多α-Syn转基因动物模型，例如A53T、A30P，此类模型可复制类似于PD患者脑内α-Syn异常聚集现象，并表现出渐进的病理变化，但通常需要较长时间，且有时难以获得目的表征。近年来病理性a-Syn的播散在PD 的发病及进展研究中日渐受到关注。越来越多的证据表明，错误折叠的a-Syn 会在相互连接的中枢神经系统区域之间扩散，促进疾病的进展［9］。PD 患者接受胚胎中脑DA 能神经元移植多年后，在移植神经元中检测到了病理性a-Syn，进一步证实了其传播性［10］。α-Syn 是由140 个氨基酸组成的小分子蛋白质，分布于突触前神经末梢，在PD 患者中常于Ser129 位点发生磷酸化，聚集成不溶性淀粉样原纤维。为研究病理性α-Syn 的致病机制，研究人员在体外合成了与病理性α-Syn原纤维结构高度相似的α-Syn PFF，并将其注射入野生型小鼠纹状体，证实α-Syn PFF 可在整个脑区引起磷酸化α-Syn 病理改变［11］。这一模型对比转基因模型建模时间较短，且PD 表型较全面，是研究PD 脑内病理改变的理想模型。非人灵长类动物食蟹猴在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，对食蟹猴进行研究获得的结果能够更好地转化应用［12］。本研究结果显示，α-Syn PFF 造模的食蟹猴对比对照组嗅球中存在大量磷酸化α-Syn 沉积，证明病理性α-Syn 能够从纹状体传播至嗅球，引起神经元损伤。

3.2 α-Syn PFF诱导嗅球DA能神经元丢失 PD最显著的非运动症状是嗅觉功能障碍，在家族性和散发性PD中均有表现，患病率为50%～96%，并且可以在运动症状出现之前至少5 年出现［13］。Braak 假说也提出嗅球是最早受累的部位之一，在病程早期即可出现α-Syn病理沉积，因此可作为PD早期诊断的特征之一［14］。Huisman 等［15］发现在早期PD 患者嗅球中DA能神经元数量显著增加，而DA能神经元数量的增加导致嗅觉信息传递的抑制，提示嗅觉减退可能与DA 能神经元代偿性增多有关。随着病程发展，代偿作用减弱，DA 能神经元数量逐渐减少。本实验中双侧纹状体注射α-Syn PFF诱导的食蟹猴模型2年后检测嗅球中DA能神经元数量下降，证明病理性α-Syn可以从纹状体注射位点传播至嗅球并造成嗅球DA能神经元丢失，这一病理改变是否会引起食蟹猴嗅觉障碍还需进一步研究。

3.3 α-Syn PFF抑制新生神经元生成 神经元数量减少通常是由于神经元死亡增加以及新生神经元生成减少所致。已有研究表明，在成年哺乳动物的大脑中DA 调节神经前体细胞的增殖，DA 能神经元丢失后嗅球中新生神经元减少［16］。对PD 患者的尸检结果与实验结果一致，患者侧脑室下区、海马齿状回颗粒下区和嗅球神经前体细胞的增生均减少，提示DA能神经元丢失可能是PD患者大脑中新生神经元生成减少的原因［17］。Winner等［18］在高表达α-Syn的转基因小鼠海马齿状回中发现α-Syn异常聚积且新生神经元生成减少，表明α-Syn 的过表达能够影响新生神经元的形成。基于以上研究基础，本实验探究了食蟹猴双侧纹状体注射α-Syn PFF能否造成嗅球DA能神经元的丢失，同时伴有新生神经元生成减少。DCX 是一种微管相关蛋白,参与新生神经元的迁移和分化，可用来标记未分化成熟的神经细胞，DCX 数量的多少可以间接反映神经元生成的能力。本实验检测到α-Syn PFF 造模的食蟹猴嗅球中TH免疫组化染色的DA能神经元和DCX阳性细胞数均减少，说明α-Syn PFF可能通过引起DA能神经元的丢失导致新生神经元生成减少，进一步促进PD的病理进程，而其能否引起食蟹猴的侧脑室下区等其他脑区出现相同的病理改变还需进一步研究。

综上所述，本实验利用食蟹猴双侧纹状体注射α-Syn PFF建立模型，发现病理性α-Syn可传播至嗅球引起神经元损伤，使嗅球中DA 能神经元大量丢失，并伴有新生神经元生成减少，这些病理改变可能与PD 的嗅觉障碍有关，为今后更好地利用α-Syn PFF建立PD模型、研究其嗅觉障碍的发病机制提供了一定基础。