CARD9基因患者轮枝镰刀菌致面部感染一例

张为粼 孙乐乐 暴芳芳 于功奇 王真真 王 川 杨 青 刘 红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院),山东省皮肤病性病防治研究所,济南,250022

镰刀菌(Fusarium)主要是植物致病真菌,存在于土壤和植物中,也可致人类感染,属于条件致病菌[1,2],分为局限性和播散性,局限性感染主要见于真菌性角膜炎[3];目前报道的可感染皮肤的镰刀菌有茄病镰刀菌(Fusariumsolani)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)等[4],轮枝镰刀菌感染的病例相对少见,且未见由基因缺陷导致感染的报道。本文报道1例患者,并对国内外已报道的12例局限性轮枝镰刀菌感染病例[5-16]进行文献复习。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者,女,41 岁。面部皮肤斑块 25 年,伴痒。患者25年前无明显诱因于右侧面颊部出现红色斑块逐渐扩大至前额及左面颊,夏季减轻,冬季加重,伴瘙痒,于当地医院按真菌感染及结核感染治疗无效。体格检查: 系统检查未见异常。皮肤科检查: 皮损分布于左右面颈部,浸润性红色斑块,右侧面颊可见一萎缩性瘢痕(图1)。血常规、肝肾功能未见明显异常。非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)qPCR阴性。皮损组织病理示: (面部)表皮假上皮瘤样增生,真皮中上层较多组织细胞、巨细胞、浆细胞、淋巴细胞浸润,少许中性粒细胞、嗜酸粒细胞。过碘酸希夫(periodic acid-schiff staining,PAS)染色:见较多圆形孢子(图2)。抗酸染色:抗酸菌阴性。

图1 1a、1b:左右面颈部浸润性红色斑块;1c:右侧面颊可见一萎缩性瘢痕

图2 2a:表皮假上皮瘤样增生,真皮中上层较多组织细胞、巨细胞、浆细胞、淋巴细胞浸润,少许中性粒细胞、嗜酸粒细胞(HE,×40);2b:PAS染色见较多圆形孢子(×400)

根据临床表现和病理检查考虑感染性肉芽肿,为进一步诊治,遂进行菌种培养及测序,以及宿主的外显子测序工作,以进一步明确致病基因。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养和鉴定方法描述 将新鲜皮肤组织块剪碎分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar ,SDA)27℃和血琼脂平板(Blood Agar, BA)35℃ 进行真菌及细菌培养15天。光镜下观察初步判断为真菌感染后,分别转种至大平皿SDA27℃培养25天和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)27℃培养20天,小培养2天后进行棉蓝染色。提取菌落DNA,应用使用内转录间隔区1(internal transcribed spacer 1,ITS1)和ITS4引物进行PCR和测序,将测序结果在NCBI Genebank及Westerdijk Fungal Biodiversity Institute(https://wi.knaw.nl/page/Pairwise_alignment)中进行比对。

1.2.2 全外显子测序及Sanger测序 基因组DNA经Bioruptor Pico超声破碎仪随机打断成长度为150～200 bp的片段进行建库,构建浓度大于25 ng/μL的文库。使用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。利用FastQC进行质控。使用BWA v0.7.17软件将测序结果与人类基因组参考序列(hg19版本)进行比对, GATK v4.0.12.0对结果进行进一步过滤。然后使用ANNOVAR软件对突变位点进行注释,筛选在已知真菌感染相关的基因[17]上是否有罕见有害突变。

利用Sanger测序对全外显子测序结果进行验证。利用网页工具primer-blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物设计,合成引物(华大基因科技有限公司,北京)。使用9700型PCR扩增仪(美国 ABI 公司)通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)对相应基因相应的外显子进行扩增。琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,并通过醋酸钠乙醇沉淀法对PCR产物进行纯化。进行测序PCR反应,并利用3500XL基因分析仪(美国ABI公司)对纯化后的测序PCR产物进行测序。

2 结果

2.1 检查结果 光镜下见透明分隔菌丝,未见孢子(图3a)。SDA培养见白色棉絮状菌落(图3b)。转种大平皿SDA及PDA培养均见白色棉絮状菌落(图3c、3d)。小培养2天棉蓝染色见透明分隔、锐角分支菌丝,未见孢子(图3e)。

图3 3a:光镜下见透明分隔菌丝,未见孢子(×40);3b:组织块SDA培养,见白色棉絮状菌落;3c:组织块菌落转种大平皿SDA培养,见白色棉絮状菌落;3d:组织块菌落转种大平皿PDA培养,见白色棉絮状菌落;3e:小培养2天棉蓝染色见透明分隔菌丝,未见孢子(×400)

培养分离真菌ITS区PCR产物测序结果比对发现与轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)ITS区序列(AY188916.1)完全吻合(图4a)。全外显子测序结果发现患者在CARD9基因上携带罕见纯合致病移码突变(c.820_821insG,p.D274Gfs*61),已有相关文献报道,同时Sanger测序证实该位点真实存在(图4b)。

图4 4a:BLAST比对,培养分离真菌ITS区与轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)ITS区序列(AY188916.1)序列完全吻合;4b:全外显子测序发现患者携带CARD9基因纯合移码突变(c.820_821insG,p.D274Gfs*61)

2.2 诊断 皮肤轮枝镰刀菌感染。

2.3 治疗及随访 伊曲康唑0.2 g/d口服,每日2次,连续治疗3个月后,皮疹大部分消退。

3 讨论

轮枝镰刀菌属于子囊菌门下的镰刀菌属,有一被广泛使用的异名串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)[18],现已被建议废弃[19]。镰刀菌属在培养过程中容易发生变异,是真菌中最难分类鉴定的属之一,大多数对于镰刀菌属的感染的鉴定没有精确到种的水平[4]。通常所说的串珠镰刀菌是重要的植物致病菌,主要感染玉米等农作物,1977年在美国首次报道从一名健康男性手上的脓疱中分离出来[20]。通过培养发现形态结构特征表现多样,目前的研究表明,在这个类群中至少存在50个以上的系统发育学种,因此,采用真菌培养的方法通常不能明确区分出所谓的“串珠镰刀菌”[19]。分子生物学技术对于菌种鉴定的准确性较高,本例患者通过对培养分离真菌进行ITS区PCR产物测序,最终确定致病菌为轮枝镰刀菌。

既往报道为串珠镰刀菌局限性皮肤感染的包括本例在内共有13例患者[5-16],皮损可呈现红斑、溃疡、结节等多种表现。根据年龄、皮损部位、流行病学、免疫状态、皮损形态,可大致分为两类人群(表1):一类为老年人,病程可长达10年以上,皮损发生于四肢尤其是远端暴露部位如足部、手部,下肢较上肢多见,多从事体力劳动,发病前多可追溯到外伤史及土壤和农作物接触史,多无明显免疫功能缺陷;一类为儿童青少年,病程通常不足1年,皮损发生于面部,流行病学及外伤史常不明确,存在结核分枝杆菌、念珠菌感染,提示可能存在免疫缺陷。本例患者16岁发病,病程长达25年,应考虑到免疫缺陷的可能。

表1 局限性皮肤串珠镰刀菌感染13例分析汇总

在近年来的研究中, 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)等炎症因子基因的突变、抗原识别受体基因的缺失、T细胞功能缺陷等,这些基因缺陷会导致机体的免疫反应降低,从而增加宿主感染深部真菌的风险。白介素17(interleukin ,IL-17)在深部真菌感染中起着重要的作用,其通过刺激粒细胞增生和黏附,帮助机体抵御病原体侵袭[21]。本例患者通过全外显子测序发现了CARD9基因纯合移码突变(c.820_821insG,p.D274Gfs*61)。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein9, CARD9) 是来自CARD蛋白家族的细胞内衔接蛋白, 主要由髓系细胞表达[22],CARD9的缺陷会导致辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)免疫缺陷,进而导致中性粒细胞对真菌的杀伤缺陷[23]。

不同的CARD9突变存在明显的地理分布和表型差异,一项对60例具有24种不同CARD9突变和不同真菌感染的患者的研究表明,p.D274Gfs*61(c.820_821insG)突变较为常见,占所有患者的8.1%,占亚洲病例的17.2%[24],相较于其他突变,p.D274Gfs*61(c.820_821insG)突变更容易引起局限性皮肤真菌感染[23]。目前所有病例均来自国内[25],主要引起暗色真菌导致的暗色丝孢霉病和着色芽生菌病[26-28],其他感染包括阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii)[23,25]、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)[29]、孢子丝菌复合体(Sporothrixschenckiicomplex)[30]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[31],本文为首例局限性轮枝镰刀菌皮肤感染伴有CARD9基因缺陷的病例。综上,病程较长的慢性真菌感染,要考虑宿主遗传缺陷的问题。

本病治疗呈慢性过程,既往报道的治疗时长7～135天不等,基本可获得痊愈。研究表明镰刀菌对不同药物的敏感性存在种间差异[32],体外药敏试验结果与临床转归不完全一致,局限性镰刀菌感染常用唑类药物[33]。尽管伊曲康唑的MIC相对较高,但是口服伊曲康唑配合外用药物是针对本病临床上最常见且效果较好的治疗方案[34]。本例患者采取伊曲康唑口服治疗,取得好转。

综上,我们首次报道了镰刀菌属真菌感染伴CARD9缺陷的病例, 丰富了CARD9缺陷疾病的表型谱。对局限性皮肤轮枝镰刀菌感染的包括外伤史和免疫状态在内的发病特点和易感人群进行了总结,也体现了真菌ITS区测序对于形态学检查不典型的病例的确诊及及时治疗所具有的重要价值。