一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

孙林慧 禚惠荣 师文君 王康琪 张东立 侯少阳

摘 要：目的：基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）），寻找并制备一对引物探针，灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法：寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）最佳反应体系，对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果，据此设计引物，快速鉴定副干酪乳杆菌。结果：根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段，设计出了一对引物探针（1145-S-F：5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3；1145-S-R：5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3）。结论：根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出，设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

关键词：副干酪乳杆菌；肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术（ERIC-PCR）；引物探针；特异性；鉴别

Abstract： Objective： To search for and prepare a pair of primer probes based on ERIC-PCR technology for sensitive and accurate identification of Lactobacillus paracasei from complex habitats. Method： To search for the optimal ERIC reaction system for Lactobacillus paracasei HP-B1145， and obtain specific bands and sequence results through the recovery and purification of ERIC fragments. Based on this， primers were designed to achieve rapid identification of Lactobacillus paracasei. Result： A pair of primer probes （1145-S-F： 5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3; 1145-S-R： 5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3） were designed based on the recovered HP-B1145 ERIC Fragment. Conclusion： Based on the comprehensive experiments of primer specificity， accuracy， universality， and content limit， the designed primers can accurately and sensitively identify Lactobacillus paracasei from complex habitats.

Keywords： Lactobacillus paracasei; enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction （ERIC-PCR）; primer probes; specificity; distinguish

2002年，欧洲食品和饲料菌种协会指出，益生菌能对宿主机体产生功能性健康益处[1]。作为人类肠道微生物群落的一个组成部分，益生菌有助于维持健康的肠道菌群环境，调节微生物的代谢活动[2]。副干酪乳杆菌是益生菌的一种，具有较高的环境耐受能力，能在宿主肠道内分泌胞外多糖，发挥降血糖作用；能促进肠道菌群降胆固醇；能将糖苷型黄酮转化为易被机体吸收的苷元型黄酮，发挥辅助降血糖的作用；能产生代谢产物，抑制病原菌生长[3-8]。副干酪乳杆菌是一种潜在的功能性益生菌，极具应用前景。目前，副干酪乳杆菌已在食品、药品、调味品和饲料等产品中发挥作用，用16S rRNA检测副干酪乳杆菌存在耗时长、操作复杂、简便性差[9-11]等特点。为改进传统方法的劣势，人们需要开发一种新型的检测技术。

1990年，SHARPLES等[12]在对Escherichia coli基因组中tsl基因的3末端区进行分析时，首次发现了肠杆菌基因间重复一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）片段并命名为“基因间重复单位”（Intergenic Repetitive Unit，IRU）序列。随后Hulton等[13]也鉴定出相同的重复序列并命名为ERIC，即肠杆菌基因间保守重复序列[14]。副干酪乳杆菌是国内外研究热度较高的一种益生菌，属于乳杆菌属的干酪乳杆菌群，具有ERIC序列。肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）是利用ERIC序列中的高度保守區设计的一对反向引物进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增，对微生物菌株的鉴定、分析等研究有较高的参考价值[15]。该技术用于微生物学研究，分析速度快，可供参考的信息量大，克服了纯培养的局限，在环境监测治理、肠道菌群生态结构研究等方面具有广泛的应用价值[16]。运用ERIC-PCR技术能大大缩短副干酪乳杆菌的鉴别时间，为副干酪乳杆菌的研究提供一种新的检测思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2K plus Ⅱ DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、T载体（T5 Zero Cloning Kit），北京全式金生物技术有限公司；引物，苏州金唯智生物科技有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；2×Taq Master Mix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；卡那霉素，北京索莱宝科技有限公司；Tris、SDS，德国Sigma公司；溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB），美国Amresco公司；琼脂糖，西班牙琼脂糖；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，康为世纪生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-75G全自动数显立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司；SW-CJ-ZFD双人单面垂直净化工作台，上海博讯实业有限公司；Eppendorf Research plus手动移液枪，德国艾本股份公司；TS100恒温混匀仪，杭州瑞诚仪器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪，伯乐生命医学产品有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市江南仪器厂；ZF-20D型暗箱三用紫外分析仪，骥辉分析仪器上海有限公司；H1650-W型高速台式离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA的提取、纯化

将从酸菜中分离到的副干酪乳杆菌HP-B1145接种至MRS固体培养基中，37 ℃厌氧环境下培养2 d，采用SDS-碱裂解法[17]提取副干酪乳杆菌HP-B1145的基因组，37 ℃烘25 min后加入50 μL 1×TE溶解DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.2 引物的设计

以副干酪乳杆菌HP-B1145为研究对象，进行多次实验，找到最佳ERIC-PCR反应条件。以副干酪乳杆菌HP-B1145基因组DNA为模板，进行ERIC-PCR，回收、纯化，得到基因组目的片段，连接T5载体，送至苏州金唯智公司测序。根据测序结果，采用Primer Premier 5和Oligo 7软件进行引物探针设计。将副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC序列上传至GenBank数据库。

1.3.3 探究引物的特异性

将乳酸片球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、动物双歧杆菌、干酪乳杆菌和大肠杆菌作为引物探针特异性检验的对照，分别对上述菌株及副干酪乳杆菌HP-B1145采用1145-S-F/1145-S-R引物探针进行PCR，并对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.4 探究引物的普适性

将副干酪乳杆菌TMPC 46M17、副干酪乳杆菌CD-M-1、副干酪乳杆菌BCRC-16100、副干酪乳杆菌AK508和副干酪乳杆菌KPP3777作为引物探针普适性检验的对照，以1145-S-F/1145-S-R为引物，分别对上述菌株及副干酪乳杆菌HP-B1145进行PCR，并对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.5 探究引物能够检测的含量限度

将乳酸片球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、大肠杆菌和副干酪乳杆菌HP-B1145混合制成副干酪乳杆菌HP-B1145含量分别为100%（绝对含量900 ng·mL-1）、70%（绝对含量630 ng·mL-1）、30%（绝对含量270 ng·mL-1）、0%（绝对含量0 ng·mL-1）的混合DNA溶液，以此混合DNA溶液为模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探针进行PCR，并对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.6 探究引物能否检验市售产品中的副干酪乳杆菌

选取3种市售配方中含有副干酪乳杆菌的产品，提取产品基因组DNA，以此为模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探针进行PCR，对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证，探究引物探针是否具有实用性。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的测序及引物设计

依据多次实验探索到的最佳反應条件，对副干酪乳杆菌HP-B1145的基因组DNA进行ERIC-PCR，得到多态性的ERIC片段，胶回收、纯化，得一条900 bp左右的DNA条带。通过测序得到DNA序列，设计引物探针，该基因片段的序列已上传GenBank数据库，接收序列号为OP681785。设计结果如下：1145-S-F：（5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3）；1145-S-R：（5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3）。引物由苏州金唯智公司合成，用所设计的引物继续实验。由SnapGene分析可知，所设计的引物可扩增副干酪乳杆菌HP-B1145的片段长度为489 bp。

2.2 引物探针具有准确性

以HP-B1145基因组DNA为模板进行PCR（反应体系：92～98 ℃预变性8～12 min，92～98 ℃变性1 min，44～46℃退火35～45 s，65～78 ℃延伸210 s，执行30～34个循环，16 ℃后延伸）并进行琼脂糖凝胶验证，由图1可知，引物探针能扩增基因组目的片段，表明引物探针具有准确性与简便性。

2.3 特异性

分别提取副干酪乳杆菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、动物双歧杆菌杆菌、干酪乳杆菌和大肠杆菌的基因组DNA，采用1145-S-F/1145-S-R引物探针进行PCR。如电泳图2所示，在众多菌株中，只有副干酪乳杆菌（1、2号泳道）扩增出对应的基因组目的片段，能被准确检出，其他菌株没有扩增出相应的基因组目的片段，证明了引物探针的特异性。

M—2K plus Ⅱ DNA marker；以副干酪乳杆菌HP-B1145基因组DNA为模板，使用引物1145-S-F/1145-S-R。

M为2K plus Ⅱ DNA marker；1到9泳道模板分别为副干酪乳杆菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、动物双歧杆菌杆菌、干酪乳杆菌、大肠杆菌的基因组DNA；1到9泳道使用的引物探针是1145-S-F/1145-S-R。

2.4 普適性

分别提取副干酪乳杆菌HP-B1145、副干酪乳杆菌TMPC 46M17、副干酪乳杆菌CD-M-1、副干酪乳杆菌BCRC-16100、副干酪乳杆菌AK508和副干酪乳杆菌KPP3777的基因组DNA，以1145-S-F/1145-S-R为引物，进行PCR，对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。实验结果如图3所示，引物探针能将副干酪乳杆菌的近缘菌株扩增出相应的基因组目的片段，能将副干酪乳杆菌HP-B1145及其近缘菌株检测出来，证明了探针的普适性。

2.5 含量限度

将乳酸片球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌、动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、大肠杆菌和副干酪乳杆菌HP-B1145混合制成副干酪乳杆菌HP-B1145含量分别为100%（绝对含量900 ng·mL-1）、70%（绝对含量630 ng·mL-1）、30%（绝对含量270 ng·mL-1）、3%（绝对含量27 ng·mL-1）、0%（绝对含量0 ng·mL-1）的混合DNA溶液，采用1145-S-F/1145-S-R引物探针进行PCR，对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。结果如图4所示，副干酪乳杆菌绝对含量为27 ng·mL-1时，运用该引物探针可检测出，证明该引物探针能在微量DNA存在时检出副干酪乳杆菌，具有特异性强、灵敏性高的特点。

M为2K Plus Ⅱ DNA marker；1、2、3、4、5、6泳道分别以副干酪乳杆菌HP-B1145、TMPC 46M17、CD-M-1、BCRC-16100、AK508、KPP3777 6株副干酪乳杆菌的基因组DNA为模板。1、2、3、4、5、6泳道使用的引物探针是1145-S-F/1145-S-R。

M为2K Plus Ⅱ DNA marker；1泳道为副干酪乳杆菌含量100%（绝对含量900 ng·mL）的验证、2泳道为副干酪乳杆菌含量70%（绝对含量630 ng·mL-1）、3泳道为副干酪乳杆菌含量30%（绝对含量270 ng·mL-1）、4泳道为副干酪乳杆菌含量3%（绝对含量27 ng·mL-1）、5泳道为副干酪乳杆菌含量0%（绝对含量0 ng·mL-1）的溶液。1、2、3、4泳道使用的引物探针是1145-S-F/1145-S-R。

2.6 市售产品验证引物的实用性

选取3种市售配方中含有副干酪乳杆菌的产品，提取产品基因组DNA为模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探针进行PCR反应，PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。如图5所示，以选取的3种产品为模板进行PCR均能扩增出相应的目的片段。

M为2K Plus Ⅱ DNA marker；1、2、3分别以市售混合益生菌产品一，市售混合益生菌产品二及市售益生菌产品三的基因组DNA为模板；1、2、3泳道使用的引物探针是1145-S-F/1145-S-R。

3 结论

基于ERIC-PCR技术获得副干酪乳杆菌HP-B1145特异性序列，序列信息已上传GenBank数据库，接收序列号为OP681785。设计了一对引物探针，即1145-S-F：（5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3）和1145-S-R：（5-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3），比对数据库发现该序列在副干酪乳杆菌中具有较高保守性，能通过简单PCR快速、准确、特异性地从复杂样品中检出副干酪乳杆菌，解决了现有检测方法操作复杂、误差大、耗时长的问题，该引物的设计为食品、制药、生物技术等领域提供了一种新的检测方法。16S rRNA序列测定结合生理生化实验鉴别副干酪乳杆菌需3 d才能获知检测结果，但是运用该研究设计的引物探针对复杂样品进行普通PCR扩增，仅在4 h内即可完成对未知菌株中副干酪乳杆菌的鉴定，操作过程简单，重复性好，可最大程度减小操作过程的误差，具有较高的应用价值。

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基金项目：山东省自然科学基金（ZR2022QB146）；菏泽学院博士基金（XY21BS35）。

作者简介：孙林慧（2002—），女，山东聊城人，本科。研究方向：药食两用微生物资源的开发和利用。

通信作者：张东立（1983—），男，山东菏泽人，本科，工程师。研究方向：药品、保健食品研发及生产质量管理。E-mail： donglifl@163.com。