肝硬化食管胃底静脉曲张患者口腔和肠道菌群变化

任海霞 平付敏 牛淑利 郭永泽 李淑霞 王建华 郭晓会 闫华楠 王恩雨 叶东

肝硬化是多种慢性肝病引起肝损伤的共同病理途径,包括肝细胞变性、坏死、肝实质被纤维化组织和再生结节替代、肝功能丧失等[1],患者晚期出现肝功能衰竭、门静脉高压和多种并发症。从21世纪开始,科学界依据消化管道与肝脏的天然解剖关系,提出了口腔-肠-肝轴理论,揭示了肝脏疾病与口腔和肠道菌群之间的关系。16S rRNA长度约1.5 kb,信息量较大且易于分析,可以体现出细菌菌属的序列及差异[2]。本研究通过16S rRNA基因测序技术分析健康人群和肝硬化食管胃底静脉曲张(CEGV)患者口腔和肠道菌群的不同,探讨口腔和肠道菌群的组成和联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究实验组(CEGV组)收集2020年6月至2021年8月在河北工程大学附属医院、邯郸市传染病医院收治的经临床、影像学、实验室、内镜等检查手段确诊为CEGV的患者(肝硬化食管胃底静脉曲张诊断参考中华医学会肝病学分会制定的《肝硬化诊治指南》)[3],收集同时期的健康志愿者作为对照组(HC组)。(1)HC组：入选标准：①家族中无肝病患者及与纳入患者无血缘关系;②既往无消化系统疾病、恶性肿瘤等病史;③近期无上呼吸道感染,无口腔疾病及牙龈出血。排除标准：①胃肠道手术史;② 1个月内使用过抗生素或益生菌。(2)CEGV组：入选标准：①肝硬化病因不限且临床资料完整;②可合并腹水。排除标准：①伴其他系统重大疾病及恶性肿瘤;②有牙科病史和口腔检查发现任何有活动性牙龈或牙周病;③合并慢性腹泻、炎症性肠病等可引起肠道菌群紊乱的患者;④有胃肠道手术史者;⑤ 1个月内使用过抗生素及益生菌。所有实验对象对本研究均知情同意,本研究获得河北工程大学附属医院伦理委员会的审核同意。

1.2 标本采集

1.2.1 唾液采集：所有研究对象至少在标本收集2 h前不进食,不饮水、不刷牙。收集过程中,受试者手拿无菌、无酶收集管,口含唾液≥1 min,随后使唾液2～5 ml流入试管中,2 h内送至实验室-86℃冰箱保存。

1.2.2 粪便采集：用粪便取样器留取粪便中段里部50～100 mg样本,每样留存2～3管备份,2 h内放入-86℃超低温冰箱保存,采集管要求无菌、密封,采集过程中避免尿液等污染。

1.3 DNA提取、16S rRNA基因文库制备、信息分析 将唾液和粪便样本放入裂解液中裂解离心得到样品DNA(起始量≥30 ng,质量要求：无色素等杂质;无降解或轻微降解;体积,容积：15 ～100 μl;浓度：6～100 ng/μl),检测NanoDrop样品浓度和1%琼脂糖凝胶样品完整性。取唾液或粪便样品与融合扩增引物(PCR引物使用细菌16S rDNA的 V3～V4区特异性引物341F和806R)配置 PCR 反应体系进行扩增;待扩增结束后,用Agencourt AMPure XP 磁珠进行纯化,溶于 Elution Buffer内,文库构建完成。使用Agilent 2100 Bioanalyzer仪器进行检测文库片段的浓度和总量片段大小。检测合格的样本pooling后,以Illumina Hiseq 2500 测序仪进行测序,测序类型为PE300,得到的Raw data经过过滤获得Clean data。通过reads间的互相重叠关系将reads拼接成Tags,聚类成OTU并与数据库比对、物种注释;基于OTU和注释结果进行样品物种分析,组间物种多样性和差异性分析。

2 结果

2.1 实验对象基本情况 选取经过纳入、排除标准及部分样本建库、质检或测序失败筛选后,最终纳入CEGV组患者17例,HC组15例,2组性别、年龄、体重指数(BMI)和吸烟、饮酒生活习惯比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组基本特征比较

2.2 OTU聚类Venn图 样品分为4组：HC组唾液(HCSa)、CEGV组唾液(CESa)、HC组粪便(HCFe)、CEGV组粪便(CEFe)。HCSa共有OTU 381个,CESa共有OTU 451个,2组共有OTU 362个;HCFe 的OTU总数527个,CEFe的OTU总数603个,2组粪便标本共有OTU总计423个;共有73个OTU相互重叠。见图1。

图1 2组唾液及粪便OTU统计

2.3 物种积累曲线 本实验抽样量足够,继续加大抽样量,可能只会发现很少的新物种,抽样结果可以代表唾液和粪便菌群特征,可以进行下一步分析。见图2。

图2 物种累积曲线

2.4 物种相对丰度分布

2.4.1 在门水平上,发现2组唾液中拟杆菌门(Bacteroidetes)为最大优势菌群,拟杆菌门、梭杆菌门(Fusobacteria)丰度构成比例差别不显著,2组唾液间变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度存在明显差异(P<0.05)。2组粪便绝对优势菌群是厚壁菌门,HC组相对丰度为52.59%,CEGV组为49.81%,2组中变形菌门相对丰度差异明显(P<0.05),与HC组粪便相比拟杆菌门、厚壁菌门呈现下降趋势。见表2。

表2 2组唾液和粪便在门水平上主要物种相对丰度构成

2.4.2 在属水平上,唾液菌群中普氏菌属(Prevotella),是相对优势菌群;粪便中,拟杆菌属(Bacteroides)、普氏菌属占比较大。与HC组唾液相比,CEGV组唾液物种韦荣球菌属(Veillonella)差异有统计学意义(P<0.05)。与HC组粪便菌群对比,CEGV组中链球菌属(Streptococcus)、韦荣球菌属、肠球菌属(Enterococcus)、颗粒链菌属(Granulicatella)相对丰度有明显差异(P<0.05)。见表3。

表3 2组唾液和粪便在属水平上主要物种相对丰度构成

2.5 LEFSe分析

2.5.1 GraPhlAn物种组成图中,2组唾液菌群最内层门水平蓝色节点最大,代表Bacteroidetes(拟杆菌门) 是最大的优势菌群,其次可见红色节点表示的厚壁菌门(Firmicutes),浅绿色表示变形菌门(Proteobacteria),绿色的梭杆菌门(Fusobacteria);外层热力图可见,HC组和CEGV组唾液物种优势菌群均为拟杆菌门下的普氏菌属(Prevotella)。2组粪便中,绿色节点代表 厚壁菌门(Firmicutes)丰度最大,其次分别为红色节点表示拟杆菌门(Bacteroidetes)和蓝色节点表示变形菌门(Proteobacteria);外层热力图说明CEGV组中丰度所占比例最大的菌群为拟杆菌门中的拟杆菌属(Bacteroides),HC组粪便菌群中优势菌群是拟杆菌门中的普氏菌属。见表4。

表4 HC组与CEGV组唾液物种LDA值比较

2.5.2 HC组粪便中苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、链球菌属(Turicibacter、Streptococcus)、Alistipes是具有显著差异的物种;CEGV组中芽孢杆菌纲(Bacilli)、红椿菌纲(Coriobacteriia)、乳杆菌目(Lactobacillales)、放线菌目(Actinomycetales)、红椿菌目(Coriobacteriales)、微球菌科(Micrococcaceae)、红椿菌科(Coriobacteriaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、韦荣球菌属(Veillonella)、罗氏菌属(Rothia)、颗粒链菌属(Granulicatella)、肠球菌属(Enterococcus)、Scardovia与健康组粪便菌群具有差异。见表5。

表5 HC组与CEGV组粪便物种LDA值

2.6 LEFSe分析 CEGV组唾液中差异显著的物种是：厚壁菌门、梭菌纲、梭菌目、韦荣球菌科、拟杆菌科、拟杆菌属、韦荣球菌属;HC组唾液中差异物种是变形菌门、γ-变形菌纲、巴斯德氏菌目、巴斯德氏菌科、放线杆菌属。HC组粪便中苏黎世杆菌目、苏黎世杆菌科、链球菌科、理研菌科、链球菌属、Alistipes是具有显著差异的物种;CEGV组中芽孢杆菌纲、红椿菌纲、乳杆菌目、放线菌目、红椿菌目、微球菌科、红椿菌科、肉杆菌科、肠球菌科、乳杆菌科、乳杆菌属、韦荣球菌属、罗氏菌属、颗粒链菌属、肠球菌属、Scardovia与健康组粪便菌群具有差异。

2.7 Alpha多样性分析 生物Alpha多样性主要是指丰富度(richness)和均匀度(evenness)这两个主要因素。Chao1、Ace指数在生态学中侧重于体现物种的丰富度,它的值表示这个样本中物种的总数,结果越高丰富度越高,Shannon、Simpson指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度,Shannon指数值越大代表群落多样性越高,而Simpson指数相反,数值越大多样性越低。2组唾液和粪便物种的抽样量已足够反应群落的多样性,HC组唾液标本的Chao1指数大于CEGV组(P<0.05);2组唾液标本间的Simpson指数比较,HC组小于GEVC组,但差异无统计学意义(P>0.05)。HC组粪便的Chao1值大于CEGV组的数值,Simpson指数小于CEGV组,表明CEGV组肠道微生物多样性存在降低趋势,但两者的Chao1和Simpson指数差异无统计学意义(P>0.05)。见表6,图3～6。

图3 2组唾液Chao1指数稀疏曲线图 图4 2组唾液Simpson指数稀疏曲线图 图5 2组粪便Chao1指数稀疏曲线图 图6 2组粪便Simpson指数稀疏曲线图

表6 2组唾液和粪便物种多样性指数比较

3 讨论

菌群的移位、过度生长与机体的健康息息相关,口腔、肠道菌群与肝硬化之间存在一定联系,提出了“口腔-肠-肝轴”的理论[1,2]。肠道细菌跟随血液循环移位到肝脏,代谢各种细菌产物,促进门静脉压力提升;而门静脉高压会使肠壁水肿,细胞间隙增大,上皮完整性被破坏,加重细菌移位的发生。肠道菌群的变化主要是由口腔细菌大量入侵引起[4],肝脏和口腔之间通过受损的肠壁建立联系,微生物及它们的代谢产物和炎症介质从口腔可直接转运到体循环[5]。

本实验结果表明样本的测序深度和抽样量足够反映物种数量和多样性。通过Alpha多样性发现2组口腔菌群的多样性差异较小,但是2组的Chao1指数差异明显,CEGV组唾液菌群的Simpson指数高于HC组,说明肝硬化食管胃底静脉曲张患者的口腔菌群的丰富度发生了改变,与Li等[6]的研究部分结果一致。从门水平上分析2组唾液标本发现口腔菌群主要是由拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门及梭杆菌门构成,两者变形菌门、厚壁菌门相对丰度构成存在显著差异,从属水平角度观察健康人群的唾液中韦荣球菌属低于CEGV组(P<0.05)。韦荣球菌属是厚壁菌门下的分支,革兰阴性专性厌氧的无芽孢球菌,迄今为止,共发现14种韦荣球菌,7种可从口腔中分离,发现其不仅与口腔疾病有关,还与肝硬化的发展存在相关性[7],Li等[6]结果与本实验研究结果一致,肝硬化患者口腔菌群中的韦荣球菌属明显增加,他们更是提出韦荣球菌属可作为预测肝病状态的生物标志物的理论。

CEGV组患者的粪便与HC组在Alpha多样性指数相比存在下降趋势,但两者的差异无统计学意义。从物种差异分析可知,2组粪便在门水平上都是由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门等物种构成,2组变形菌门含量存在明显差异,从属水平上可见,链球菌属、韦荣球菌属、颗粒链球菌属和肠球菌属相对丰度差异明显。变形菌门是细菌门水平上最大的一类,因门下的细菌形状具有多样化而得名,其外膜主要有脂多糖构成,研究发现变形菌门是人体微生物中最不稳定的,它的丰度增多提示肠道菌群结构紊乱,是一些疾病的潜在致病原因[8]。

在Beta多样性降维分析中,粪便和唾液菌群可清楚的分为两簇,两类样本的空间定位不一致,唾液菌群主要聚集在口腔中,粪便菌群分布较之更为广泛,包括胃腔、小肠和大肠等。Venn图显示粪便中细菌物种数量多于口腔微生物数量,它们共享有73个物种,粪便与口腔菌群门水平上主要菌群构成相似。从属水平上分析,HC组和CEGV组唾液中优势菌群均为普氏菌属,HC组粪便菌群同样为普氏菌属。口腔寄生菌中常见的奈瑟菌属、卟啉单胞菌属、纤毛菌属和颗粒链球菌属在健康人的肠道中存在很少,但由于肝硬化食管胃底静脉曲张的影响,在CEGV组粪便发现其存在的比例高于健康人的粪便中,颗粒链球菌属在2组粪便中具有统计学差异。颗粒链菌属属于人类口腔常见的优势菌,无动力、不形成芽孢的革兰阳性球菌,除了与口腔疾病有密切关系,还与机体多系统疾病有关联。加州大学一项关于30例肝硬化患者的研究中发现,颗粒链菌属在肝硬化合并肝性脑病的患者中比肝硬化无肝性脑病的患者增加3.1倍[9],与本研究相同,另外还发现2组人群口腔中颗粒链球菌属差异不明显而肠道菌群中丰度所占比差异较大。有关成年人及老年人口腔菌群和肠道菌群的研究中发现,老年人较成年人的口腔菌群在肠道中出现更为普遍,导致这个现象出现原因很大部分是老年人胃肠道功能减退,胆汁酸和胃酸合成功能受到影响[10]。GEGV患者因血管扩张充血,影响食管下括约肌的功能,动静脉短路,有效循环血流减少,肠壁黏膜损伤,防御机制及胃肠动力功能、自主神经功能减弱,在这种环境下,菌群移位的发生概率更高。本研究发现,在GEGV状态下,颗粒链球菌属、卟啉单胞菌属、纤毛菌属更容易向肠道中转移。

综上所述,GEGV患者与健康人群口腔菌群在门水平和属水平部分菌属之间相对丰度存在差异,且健康人的口腔菌群的丰富度较高,2组人群肠道菌群属水平上韦荣球菌属、颗粒链球菌属、肠球菌属和链球菌属相对丰度不同,肝硬化食管胃底静脉曲张患者肠道菌群Alpha多样性有下降的趋势,且富集于口腔中的部分菌属在肝硬化食管胃底静脉曲张患者的体内可能向肠道中转移。