miRNA-144-3p靶向CCNE2调控肺腺癌细胞周期并抑制其增殖

王江波,梁 皓*,陆允平

0 引言

肺癌(Lung cancer,LC)是一种发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤[1-3],是癌症死亡的主要原因之一[4]。近期有报道显示,每年预计有220万例新发肺癌病例和180万例新发死亡病例[5]。肺腺癌作为肺癌的主要组织学类型,约占肺癌病例的50%[6]。随着技术的发展和新治疗手段的开发,肺腺癌的早期诊断领域已取得了一定的进展,但肺腺癌患者的5年生存率仍然很低,复发率仍较高[7],因此,阐明肺腺癌发展涉及的分子机制,确定肺腺癌的新型预后生物标志物和治疗靶点,对于肺腺癌的治疗具有重要的临床价值[8-9]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类短(18～24个核苷酸)的单链非编码RNA[10],主要通过结合mRNA的3′末端非翻译区(3′-untranslated region,3-UTR)来沉默mRNA表达或降解靶mRNA,从而起到调控作用[11]。Zhang等[12]研究发现,在乳腺癌细胞中,miR-1894-3p可以直接靶向mRNA Trim46的3′-UTR,下调Trim46的表达,进而抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。已有多项研究表明,肺腺癌细胞的恶性进展受到miRNA的直接调控,如miRNA-126可增强肺腺癌细胞的增殖、迁移能力[13],miRNA-217上调可抑制FOXP1的表达,进而抑制肺腺癌的进展[14]。miRNA-454-3p受到lncRNA HOXA11-AS的调控,影响肺腺癌细胞的顺铂耐药性[15]。然而miRNA-144-3p在肺腺癌中的研究却较少,其影响肺腺癌恶性进展的分子机制有待进一步研究确认。

细胞周期蛋白E2(Cyclin E2,CCNE2)是细胞周期蛋白(cyclin)家族的成员之一,能够通过激活其细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)来驱动肿瘤细胞增殖[16]。CCNE2 可以调节细胞周期G1期向S期转化,并在DNA复制、基因组稳定性控制等方面发挥功能[17]。现已有多篇文献报道,CCNE2在肝癌[16]、乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、胰腺癌[20]等肿瘤中异常表达。如CCNE2在胃癌中显著高表达,能够促进胃癌细胞的细胞周期进程[21]。在肝细胞癌中CCNE2 的过表达会促进癌细胞的生长[22]。但是CCNE2在肺腺癌中的分子机制研究还较少。

本实验以人肺腺癌细胞为体外研究对象,研究miRNA-144-3p和CCNE2对肺腺癌细胞的增殖能力、细胞周期的调控机制,旨在为肺腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞和样本来源 人肺腺癌细胞Calu-3、SPC-A-1、GLC-82和人胚肺成纤维细胞MRC-5均购自北纳菌种保藏中心(BeNa Culture Collection,BNCC),货号分别为BNCC338514、BNCC100120、BNCC338287、BNCC338054。从濮阳市人民医院收集心胸外科手术切除的新鲜肺腺癌组织标本和配对癌旁组织(距癌组织3～5 cm)标本各20例。

1.2 主要试剂与仪器 10%胎牛血清、DMEM培养基、双抗青/链霉素购自美国Gibco公司(货号：10099、51985034、15140122);Lipofectamine®2000试剂、Trizol试剂、cDNA合成试剂盒购自美国赛默飞公司(货号：11668019、A33250、11752025);miScript SYBR Green PCR 试剂盒购自德国Qiagen公司(货号：331223);CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司(货号：CK04);双荧光素报告载体构建自中国genePharma,双荧光素报告检测系统购自美国Promega 公司(货号：N1610);100%乙醇购自嘉鼎化学(货号：MFCD00003568);碘化丙啶、TBST、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RNA酶、封闭液、ECL试剂盒均购自碧云天生物公司(货号：ST511、ST673、P0010、ST040、P0252、P0018S);兔单克隆抗体GAPDH、兔单克隆抗体CCNE2、辣根过氧化酶标记的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)均购自英国Abcam公司(货号：ab181602、ab40890、ab205718)。

细胞培养箱购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司(型号：BB150);冷冻离心机购自美国赛默飞公司(型号：Heraeus Fresco 21);多功能酶标仪购自美国Bio-Tek公司(型号：ELX800UV);正置光学显微镜(Nikon Eclipse E100)、倒置荧光显微镜(MCT-001-150-S)购自日本Nikon公司;电泳仪购自韦克斯科技(北京)有限公司(型号：WIX-midiDNA)。7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司(型号：Prism®7500);6孔培养板、48孔培养板、96孔培养板和Transwell 小室均购自美国 Corning 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 所有细胞均用加入1%双抗并且含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养[23]。

1.3.2 载体构建和细胞转染 细胞生长至对数期时,将阴性对照模拟物(NC mimic)、微小RNA-144-3p模拟物(miRNA-144-3p mimic)以及周期蛋白E2的过表达质粒载体(oe-CCNE2)和阴性对照(oe-NC)经Lipofectamine®2000试剂瞬时转染到肺腺癌细胞中,同样将阴性对照抑制剂(NC inhibitor)、微小RNA-144-3p抑制剂(miRNA-144-3p inhibitor)以及周期蛋白的敲低质粒载体(sh-CCNE2)和阴性对照(sh-NC)经Lipofectamine®2000试剂瞬时转染到肺腺癌细胞中,并在对应的培养基5%CO2、37 ℃培养,6 h后更换培养基继续培养48 h进行后续实验。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction) 用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。为了检测miRNA-144-3p和CCNE2 的mRNA表达,使用cDNA合成试剂盒将1 μg的miRNA-144-3p和CCNE2总RNA分别用于合成cDNA。使用miScript SYBR Green PCR 试剂盒在以下热循环条件下进行定量PCR,miR-144-3p和CCNE2内参物分别为U6和GAPDH,PCR条件：95 ℃ 2 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循环40次。2-ΔΔCt法用于测定相对基因表达。引物序列见表1。

1.3.4 细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖 用CCK-8试剂盒进行细胞增殖测定。将肺腺癌细胞系GLC-82的细胞(6×103个细胞/孔)接种在24孔板中。待细胞贴壁后,更换新鲜培养基100 μl,再加入CCK-8液10 μl,将细胞置于37 ℃孵育。在转染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h检测450 nm处的吸光度,实验重复3次。

表1 引物序列

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验 将GLC-82细胞以6×105个细胞/孔接种在24孔板中并孵育24 h。随后,用0.8 μg pGL3-CCNE2-3′UTR WT和pGL3-CCNE2-3′UTR Mut质粒,用0.08 μg phRL-SV40对照载体共转染细胞,然后使用Lipofectamine 2000试剂盒将miRNA-144-3p mimic及其阴性对照分别转染到细胞中。在转染后24 h,使用双荧光素酶测定法检测海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性,实验重复3次。

1.3.6 流式细胞术分析细胞周期 细胞培养48 h,并在冰冷的70%乙醇中固定12 h。洗涤后,将细胞与0.25 mg/ml RNase在37 ℃孵育30 min。将细胞重悬于碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)溶液(50 μg/ml)中,并通过流式细胞术进行细胞周期分析。

1.3.7 免疫印迹(Western blot,WB) 细胞转染48 h后,将各组细胞使用冷PBS洗涤3次,加入全蛋白裂解液(RIPA)后冰上裂解10 min,离心,收集上清液,BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。上清液与上样缓冲液混匀后,95 ℃变性10 min,取60 μg总蛋白在100 V的恒压下使用SDS-PAGE胶分离。电泳结束后,以100 mA、120 min将蛋白转移至NC膜,封闭液(5% BSA/TBST)封闭60 min,加入一抗,4 ℃过夜孵育。其中一抗分别为：兔单克隆抗体GAPDH(1∶10 000),兔单克隆抗体CCNE2(1∶10 000)。一抗孵育完毕后,用1×TBST溶液室温下摇床摇动洗膜,洗3次,每次5 min,加辣根过氧化酶标记的二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶20 000),室温下孵育120 min,1×TBST洗膜3次,每次20 min后,用ECL试剂盒进行发光反应,观察蛋白印记,并进行图像分析。实验重复3次。

2 结果

2.1 miRNA-144-3p在肺腺癌中低表达 由癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载数据,结果显示,miRNA-144-3p在肺腺癌组织中表达显著下调(图1A)。临床样本检测结果显示,相比于癌旁组织,癌变组织的miRNA-144-3p表达水平显著降低(图1B)。采用实时荧光定量PCR分别检测miRNA-144-3p在人肺腺癌细胞Calu-3、SPC-A-1、GLC-82和人胚肺成纤维细胞MRC-5中的表达水平,结果显示,与肺成纤维细胞相比,miRNA-144-3p在肺腺癌细胞中的表达显著降低(图1C),此外,由于miRNA-144-3p在GLC-82细胞系中下调最明显,因此选择该细胞系进行后续实验。

图1 miRNA-144-3p在肺腺癌中低表达

2.2 过表达miRNA-144-3p抑制细胞增殖 向GLC-82细胞中转染miRNA-144-3p mimic,以检测miRNA-144-3p对肺腺癌细胞增殖的影响。qRT-PCR结果显示,转染miRNA-144-3p mimic的肺腺癌细胞相较于转染NC mimic的细胞,其miRNA-144-3p表达量显著增加(图2A)。CCK-8实验结果显示,与NC mimic组相比,过表达miRNA-144-3p后,肺腺癌细胞的增殖能力显著下降(图2B)。

图2 过表达miRNA-144-3p抑制细胞增殖

2.3 验证miRNA-144-3p与CCNE2的靶向性 miRNAs通常会与下游mRNAs发生作用,表现出抑制功能。因此,应用starBase、miRDB、miRWalk数据库对miRNA-144-3p进行靶基因预测,并与TCGA数据库中分析得到的表达上调基因取交集,结果显示,miRNA-144-3p下游存在靶基因CCNE2,同时用TCGA数据库分析CCNE2的表达水平,结果发现,其在肺腺癌组织中显著高表达(图3A)。临床样本检测结果显示,相比于癌旁组织,癌变组织CCNE2的表达水平显著升高(图3B)。本研究选择相应细胞系,采用qRT-PCR和WB实验检测CCNE2的表达情况。结果显示,与正常细胞系相比,CCNE2在肺腺癌细胞系中均表现为表达上调(图3C)。通过靶基因预测软件miRTarBase预测miRNA-144-3p与CCNE2的靶向结合位点(图3D),采用双荧光素酶实验以验证CCNE2和miRNA-144-3p之间的靶向关系,结果见图3E,在CCNE2野生型组中miRNA-144-3p mimic处理显著降低了荧光素酶报告基因活性,而在CCNE2突变型组中miRNA-144-3p的过表达对荧光素酶活性无显著影响,表明CCNE2和miRNA-144-3p可以特异性结合。qRT-PCR和Western blot结果(图3F)显示,肺腺癌细胞转染miRNA-144-3p mimic后,CCNE2蛋白的mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组,而转染了miRNA-144-3p inhibitor后,CCNE2蛋白的mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组。综上,miRNA-144-3p能靶向下调CCNE2。

图3 验证miR-144-3p与CCNE2的靶向性

2.4 miRNA-144-3p靶向下调CCNE2,抑制细胞增殖,阻滞细胞周期 为了研究miR-144-3p与CCNE2在肺腺癌中的调控作用,本研究构建了不同的表达处理组,采用qRT-PCR和Western blot检测转染效果,结果见图4A。图4A结果显示,过表达CCNE2后,CCNE2表达水平显著升高,进一步过表达miRNA-144-3p后,CCNE2表达水平显著降低,恢复至oe-NC+NC mimic组水平。此外,采用CCK-8检测不同处理组细胞的增殖能力,结果显示,肺腺癌细胞在单独过表达CCNE2后,其细胞增殖能力显著提高。当共转染oe-CCNE2和miRNA-144-3p mimic时,相对于只转染oe-CCNE2组,细胞增殖能力显著降低,但依旧高于oe-NC+NC mimic组(图4B)。各组细胞的细胞周期见图4C,结果显示,转染oe-CCNE2的细胞和对照组相比,S期细胞占比显著增加,G1期细胞占比减少,细胞周期进程加快。共转染miRNA-144-3p mimic和oe-CCNE2的细胞相较于只转染oe-CCNE2的细胞,S期细胞占比显著减少,G1期细胞占比增加。另外,本研究验证了敲低miRNA-144-3p对CCNE2的调控作用。结果如图4D-F所示,敲低CCNE2后,细胞增殖能力显著降低,G1期细胞显著增加,S期细胞显著减少,进一步加以miRNA-144-3p inhibitor处理后,GLC-82细胞中CCNE2表达水平、细胞增殖能力和细胞周期水平恢复至sh-NC+NC inhibitor组水平。结果表明,miRNA-144-3p可靶向CCNE2调控肺腺癌细胞增殖和细胞周期。

图4 miRNA-144-3p靶向下调CCNE2,抑制细胞增殖并阻滞细胞周期

3 讨论

尽管近几十年来肺癌的诊断和治疗技术取得了重大进展,但治疗效果仍不尽人意,患者预后效果不理想[24]。因此,迫切需要开发针对肺腺癌恶性进展有效且安全的疗法。国内研究表明,miRNA在调节肺腺癌发生发展中起着至关重要的作用,例如miRNA-148b-3p与肺腺癌的肿瘤等级和肿瘤大小显著相关,是肺腺癌患者整体生存的独立预测标志物[25];miRNA-375在肺腺癌中显著上调,其调控作用对肺腺癌的进展至关重要[26];miRNA-145靶向N-cadherin 抑制肺腺癌细胞的转移能力等[27]。因此,本研究探究了在肺腺癌中异常表达的miRNA-144-3p对癌细胞表型的影响及其下游相关的分子机制。

miRNA-144-3p在癌症研究中已被广泛报道,其参与了肝癌、鼻咽癌、甲状腺肿瘤、肾透明细胞癌、喉鳞状细胞癌等多种癌症的发生和发展[28-32]。如miRNA-144-3p的异位表达显著阻断了肺鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[33]。miRNA-144靶向PURA,抑制了食道癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力[34]。miRNA-144-3p对EGFR的负调控可对骨肉瘤的生长和迁移起到负面影响[35]。由此,miRNA-144-3p在肿瘤中的调控作用是普遍存在的。本研究通过分析TCGA数据及细胞实验,确定miRNA-144-3p在肺腺癌组织和细胞中显著低表达,CCK8实验验证了miRNA-144-3p能够抑制肺腺癌细胞的增殖。

有研究表明,miRNA-144-3p可通过靶向不同的基因,如RP105[36]、YAP[37],从而起到调控肿瘤发生发展的作用。因而,为了探究miRNA-144-3p影响肺腺癌恶性进展的分子机制,我们利用targetscan网站,挖掘得到与miRNA-144-3p有靶向结合关系的下游基因CCNE2。此外,双荧光素酶实验也证明了两者的靶向结合关系。CCNE2是细胞周期家族的成员之一,通过激活其激酶伴侣细胞周期蛋白依赖性激酶2来驱动细胞周期G1期向S期转化[17],以促进细胞增殖[22]。在卵巢癌中CCNE2显著上调,并与患者的预后不良相关[38]。在非小细胞肺癌中CCNE2受miRNA-3607-3p的靶向调控,影响癌细胞的增殖和迁移能力。在本研究中,我们通过体外实验发现过表达miRNA-144-3p 能够逆转CCNE2对肺腺癌细胞增殖能力和周期分布的影响。

综上,本研究表明,在肺腺癌细胞中miRNA-144-3p表达显著下调,而CCNE2表达显著上调。并且miRNA-144-3p能够通过靶向CCNE2发挥抑制肺腺癌细胞增殖,并将细胞周期阻滞于G1期的作用,表明miRNA-144-3p可能是肺腺癌治疗的潜在分子靶标。但是本研究有不足之处,如主要以肺腺癌细胞株为研究对象,通过体外实验验证了该分子机制,后续还有待利用动物实验等进行进一步验证和完善,未来还需纳入临床样本进行检测和前瞻性分析,使其真正能应用于临床。