Let-7d、α-SMA在主动脉夹层患者中的表达及其临床意义

曹金龙，马鸿兰

西安医学院第一附属医院心血管内科，陕西 西安 710077

主动脉夹层(aortic dissection，AD)是一种在短期内危及生命的血管疾病，其不仅会造成循环系统障碍，还会造成肝肾等重要脏器缺血从而引起严重并发症。AD临床表现具有多样化，主要表现为突发胸痛、腹痛、高血压，并可能表现为神经缺损和晕厥等，从而导致AD 早期确诊率较低，易于出现漏诊或误诊现象[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)功能为收缩血管、维持血管完整性及血管弹性，是主动脉膜中重要构成成分。α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle protein，α-SMA)是VSMC 中普遍存在的一种骨架蛋白，也是VSMC 表型转化的标志蛋白。在AD 发生、发展中VSMC 转化和凋亡的表型具有重要的作用，且该过程受到多种信号通路的调节[2]。miRNA 是一种参与多种生物学过程的非编码RNA，已证实多种miRNA在AD患者组织表达水平异常[3]。研 究 表 明，miR-124、miR-221/222 通过调控VSMC 的增殖、表型和迁移功能的改变，对主动脉中膜的弹性变化产生影响，从而参与AD 的发生[4]。Let-7 是最先在线虫中发现的一种miRNA，具有高度保守性，在心血管组织中特异性表达，从而参与心血管疾病的病理过程[5]。目前对Let-7 与α-SMA 在AD中的作用研究较少。本研究通过检测AD 患者血清Let-7d、α-SMA 的表达水平，以探究Let-7d、α-SMA与AD的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年5 月至2022 年5 月西安医学院第一附属医院收治的108 例AD 患者(AD组)为研究对象。纳入标准：(1)符合《2014 欧洲心脏病学会主动脉疾病诊治指南》的诊断标准[6]；(2)经核磁共振或主动脉CT 血管成像检查，确诊为AD；(3)患者及其家属签署知情同意书。排除标准：(1)患有先天性心血管疾病；(2)马凡氏综合征等遗传性血管疾病；(3)肝、肾等功能异常；(4)患有系统性炎症疾病；(5)创伤性或医源性夹层。AD 组中男性67 例，女性41 例；年龄32~67岁，平均(51.75±9.63)岁；体质量指数(23.04±1.92)kg/m2。选取同期西安医学院第一附属医院108 例健康体检者作为对照组，其中男性63 例，女性45例；年龄30~66岁，平均(49.33±8.59)岁；体质量指数(22.62±2.15)kg/m2。两组受检者的性别、年龄、体质量指数比较差异均无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究经西安医学院第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器 RNA 提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)购自日本TAKARA公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；α-SMA酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。NanoDrop NA-2000超微量分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific 公 司；ABI 7500 实 时 荧 光 定 量PCR(qRT-PCR)仪购自美国ABI公司。

1.3 检测方法

1.3.1 血液样品收集与处理 采集AD 组患者及对照组空腹外周血10 mL，转入无RNA 酶离心管中，3 000×g，4℃，离心15 min，之后将上清液置于新无RNA酶离心管中，于-80℃冰箱中保存。

1.3.2 血清Let-7d 水平检测 采用qRT-PCR 法检测血清Let-7d 水平。利用RNA 提取试剂盒，按照说明书操作标准抽提血清总RNA，利用NanoDrop NA-2000超微量分光光度计测定RNA浓度，使用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，然后按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书配制反应体系，并在ABI 7500实时荧光定量PCR上分析样品，反应体系共15 µL：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ7.5 µL，cDNA 样品1µL，上下游引物(10µmol/L)各0.5µL，补充ddH2O至15 µL。反应条件：95℃60 s；95℃30 s、60℃30 s，共计40个循环。以U6作为内参，采用2-△△CT法分析血清Let-7d的表达水平。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3.3 α-SMA 水平检测 利用ELISA 法检测血清α-SMA水平，严格按照说明书进行操作。

1.4 统计学方法 应用SPSS21.0 统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本t 检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Pearson 相关系数法分析AD 患者血清Let-7d 与α-SMA 之间的相关性；绘制受试者工作特征曲线(ROC)评价血清Let-7d、α-SMA 对AD 的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的血清Let-7d、α-SMA 水平比较 与对照组比较，AD 组患者血清Let-7d、α-SMA水平明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组受检者的血清Let-7d、α-SMA水平比较(±s)Table 2 Comparison of serum Let-7d and α-SMA levels between the two groups(±s)

表2 两组受检者的血清Let-7d、α-SMA水平比较(±s)Table 2 Comparison of serum Let-7d and α-SMA levels between the two groups(±s)

组别AD组对照组t值P值例数108 108 Let-7d/U6 0.64±0.17 1.03±0.21 15.001 0.001 α-SMA(ng/mL)49.83±8.77 70.61±21.44 9.323 0.001

2.2 血清Let-7d、α-SMA水平与AD患者临床资料的关系 以AD患者血清中Let-7d表达水平平均数分为Let-7d 高表达组50 例，低表达组58 例；以AD 患者血清中α-SMA 水平平均数分为α-SMA 高表达组57 例，低表达组51 例。AD 患 者血清 中Let-7d、α-SMA 水平与性别、年龄、吸烟、高血压、Standford 分型有关(P<0.05)，见表3。

表3 血清Let-7d、α-SMA水平与AD患者临床资料的关系[例(%)]Table 3 Relationship between serum Let-7d,α-SMA levels and clinical data of AD patients[n(%)]

2.3 AD 患者血清Let-7d 与α-SMA 水平的相关性 经Pearson 相关分析结果显示，AD 患者血清中的Let-7d 与α-SMA 呈正相关(r=0.663，P<0.05)，见图1。

图1 AD患者血清Let-7d和α-SMA水平的相关性Figure 1 Correlation between serum Let-7d and α-SMA levels in patients with AD

2.4 血清Let-7d、α-SMA对AD的诊断价值 经ROC 分析结果显示，血清中Let-7d 水平诊断AD的曲线下面积(AUC)为0.860，敏感度为80.6%，特异性为82.4%，95%置信区间(CI)为0.807~0.912，截断值为0.83；血清中α-SMA 水平诊断AD 的AUC 为0.807，敏感度为83.3%，特异性为75.0%，95%CI 为0.745~0.868，截断值为58.86 ng/mL，见表4和图2。

图2 ROC曲线分析图Figure 2 ROC curve analysis chart

表4 血清Let-7d、α-SMA对AD的诊断价值Table 4 Analysis of the diagnostic value of serum Let-7d and α-SMA in AD

2.5 影响AD发生的相关因素 将是否发生AD作为因变量，以性别、年龄、吸烟、血清Let-7d、α-SMA水平作为自变量进行多因素Logistic 回归分析，结果表明Let-7d、α-SMA 是AD发生的影响因素(P<0.05)，见表5。

表5 影响AD发生的多因素Logistic回归分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors of AD

3 讨论

随着现代生活节奏的加快，心血管疾病的发病率呈逐年上升趋势。AD是严重威胁人类生命健康的心血管疾病之一，研究表明AD 的发生与性别、年龄、吸烟、高血压等因素有关[7]。王晓敏等[1]研究表明AD 患者中，男性发病人数多于女性，并且大多患者伴有高血压病史。此外，伴有马凡氏综合征、埃莱尔-当洛综合征、主动脉瓣二叶式畸形等遗传病患者易患AD[8]。研究显示，免疫细胞如巨噬细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞等以及免疫因子包括白细胞介素(ILs)、骨桥蛋白、γ干扰素等免疫炎症机制与AD 的发生有关[9]。因此，AD 的发生受到个人习惯、遗传、免疫炎症等多种因素的影响，发病机制复杂。

血管重构被认为是AD发生的主要因素之一。血管重构指血管舒缩功能紊乱，细胞外机制的合成与降解失衡以及管壁细胞发生增殖、迁移、表型转化和凋亡[10]。VSMC 位于血管中膜，在正常、成熟的VSMC中主要是以收缩型为主，病理条件下VSMC由收缩型转化为合成型[11]，血管壁弹性降低，从而可能发生AD。α-SMA 属于肌动蛋白亚类，是细胞骨架的主要成分，主要在分化型细胞中表达，是VSMC 早期分化的特异性标志物。Li 等[12]研究发现AD 患者组织中α-SMA 表达降低，VSMC 为去分化型，表明去分化型VSMC 对AD 发病机制中有一定的影响。本研究对AD患者血清α-SMA水平进行检测，结果表明α-SMA在AD 患者血清中水平降低，与以上研究一致，表明α-SMA 与AD 的病变密切相关。ROC 曲线分析结果表明α-SMA对AD具有诊断价值，敏感度与特异性均较好，提示α-SMA可以作为诊断AD的潜在标志物。

Let-7 家族是一种高度保守性的miRNA，广泛存在于各种生物体内，能够参与多个生物学过程。其中，Let-7 是一种肿瘤抑制基因，在肿瘤细胞增殖与分化中有重要作用[13-15]。近年来，随着对Let-7 研究的深入，发现Let-7 在VSMC、内皮细胞和心肌细胞中表达，与心血管系统疾病发生发展有密切关系[16]。Wong等[17]研究表明Let-7d-3p表达水平的增加对缺氧肌细胞H9C2 和原代乳鼠心室肌细胞具有保护作用，在心肌缺血和心力衰竭疾病中是潜在治疗靶点。另有学者通过对AD患者血清5种miRNA的表达水平进行分析，发现其表达水平均下降，并认为血清miRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)有作为AD早期快速诊断生物标志物的应用潜能[18]。本研究通过对AD 患者血清Let-7d 表达水平进行检测，发现Let-7d 在AD 患者血清中表达水平降低，提示Let-7d 可能是检测AD 的潜在标志物。Sung等[19]研究表明，骨髓间充质干细胞Let-7表达下调，IL-6 表达上调，二者呈现负相关。免疫因子参与AD 的炎症反应，IL-6 的减少会延缓AD的发生，猜测Let-7d 可能通过调节炎症水平变化，从而对AD 产生抑制作用[20]。ROC 曲线分析表明Let-7d 对AD 具有诊断价值，敏感度与特异性均较好。本研究中AD患者血清中Let-7d、α-SMA 水平与性别、年龄、吸烟、高血压、Standford分型有关，提示血清Let-7d、α-SMA 水平与AD 患者个人生活习惯、Standford分型有关。对Let-7d与α-SMA进行相关性分析发现，Let-7d 与α-SMA 存在明显正相关，提示Let-7d、α-SMA 可能参与AD 发病过程。本研究通过Logistic 分析表明，α-SMA、Let-7d 是AD 的影响因素，表明二者在AD 发生发展中起着重要作用，虽然有关α-SMA、Let-7d 与AD 病变机制尚不清楚，但通过本研究可为临床对AD 进行诊断、治疗、新药物研发提供思路。

综上所述，AD患者血清Let-7d、α-SMA表达水平降低，Let-7d、α-SMA 是AD 发生的影响因素，可作为评估AD 发生的血清学指标。本研究尚存在不足之处，如Let-7d、α-SMA 在AD 疾病中发挥作用的确切机制需待进一步研究。