恩度抑制大鼠肝纤维化与肝癌的机制研究

杨国威，杜莹莹，程序，谭莉霞，王航宇，董勇，仝甲钊，武利萍

河南大学第一附属医院消化内科，河南 开封 475001

肝癌为导致全球患者死亡第二大癌症，我国肝癌发病率、中标率及世标率分别为24.09/10 万、12.73/10 万、13.89/10 万，由其所致疾病与经济负担逐渐成为重要公共卫生问题[1]。研究显示超过80%肝癌患者病情进展经历了慢性肝炎、肝纤维化、肝癌这一逐步进展过程[2]。研究者们近期尝试从分子层面解释肝纤维化-肝癌发生具体机制，以便通过靶向特定分子延缓甚至阻断肝脏疾病进展[3]。转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)为促进肝纤维化独有因子，其涉及TGF-β/Smad 信号通路介导了肝纤维化-肝癌过程[4]。恩度可以经由抑制TGF-β表达而减轻TGF-β诱导纤维化作用，进而发挥明显抗纤维化作用[5]。基于此，本研究探究恩度对大鼠“肝纤维化-肝癌”抑制作用及具体作用机制，为后期肝癌抗肿瘤治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠90 只，体质量180~200 g，在医院动物房以标准饲料分笼饲养，饲养温度20℃~25℃，可以自由进食饮水，光照与黑暗时间均为12 h。

1.2 仪器与试剂 JA1003 型号天平购自上海精科仪器有限公司，光学显微镜购自日本奥林巴斯公司，Multiskan MK3 型号酶标仪购自Thermo Labsystems 公司，LEICARM2035 型号生物组织石蜡切片机购自湖北孝感市亚光医用电子技术有限公司，BM-Ⅱ型号包埋机购自安徽电子科学研究院，IQTM5 型号实时荧光逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)购自美国Bio-Rad 公司，DYY-8B 型电泳仪购自北京六一仪器厂，Tanon 型号凝胶成像分析仪购自上海天能科技有限公司；DEN 购自美国Sigma 公司，恩度购自山东先声麦得津生物制药有限公司，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)素购自BASO 生物科技有限公司，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白 蛋 白(albumin，ALB)、总胆红素(total bilirubin，TBI)酶联免疫吸附试剂盒均购自四川迈克生物科技股份有限公司，羟脯氨酸及碱性磷酸酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Trizol 试剂盒、High-capacity cDNA reverse transcription kits均购自美国Gene Copoeia公司，蛋白裂解液、二辛可宁酸(bicinchoninic acid assay，BCA)试剂盒均购自金克隆(北京)生物技术有限公司，兔TGF-β1、转化生长因子-β受体Ⅰ(transforming growth factor-β recipient Ⅰ，TβRⅠ)、转化生长因子-β受体Ⅱ(TβRⅡ)、Smad2/3 均购自美国Cell Signaling Technology 公司，小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，辣根过氧化酶标记山羊抗兔、抗小鼠抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，发光液购自北京伊塔生物科技有限公司。

1.3 大鼠模型构建及分组 90 只小鼠在动物房适应性饲养1周，将所有小鼠随机分为正常组、模型组、恩度组，每组30只。模型组以10 mg/kg浓度腹腔注射0.2%DEN，每周5次，连续注射16周，对照组以9 g/L浓度注射等量注射生理盐水，于8 周、12 周、16周分别处死5只进行病理检测，以明确预期病理分型。确定病理分型后恩度组于尾静脉以20 mg/(kg·d)剂量注射恩度，此时对照组与模型组注射等量9 g/L浓度生理盐水，继续注射，饲养至20周处死小鼠。小鼠处死前收集心脏血测定肝功能指标及纤维化指标，处死后获得肝脏组织行病理检测与相关信号通路mRNA及蛋白测定。

1.4 肝组织大体形态观察 观察8 周、12 周、16周及20周处死大鼠完整肝脏组织，统计肝表面结节数量，将大鼠肝组织肿瘤剥离，称重肝组织肿瘤，统计瘤重、肝脏指数、抑瘤率，肝脏指数=肝脏组织重量/总重量×100%，抑瘤率=(模型组瘤重-恩度组瘤重)/模型组瘤重×100%。

1.5 肝组织病理检测 恩度注射4 周后将大鼠处死后收集肝组织应用4%多聚甲醛固定后行石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、HE染色、脱水、封片等处理，随后置于光学显微镜下观察拍片，并行肝纤维化分级[6]评估，0 级为组织中无纤维化，1 级为肝小叶中有纤维瘢痕或者肝窦附近及汇管区出现纤维化，2 级为大部分肝小叶结构完整，但是可以观察到纤维存在间隔，3级为肝小叶可以观察到紊乱，纤维间间隔较多，但是未达到硬化标准，4级为肝实质损伤，出现纤维弥漫性增生，可见假小叶，且肝组织显示为肝硬化前期，0 级、1 级、2级、3级与4级分别计分0分、1分、2分、3分、4分。

1.6 肝功能指标及纤维化指标测定 最后一次给药结束后第2天，以50 mg/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉处理大鼠收集心脏血500 μL，离心后获得血清，采用酶联免疫吸附试剂盒测定ALT、AST、ALB、TBI等肝功能指标。采用比色法测定羟脯氨酸及碱性磷酸酶等纤维化指标水平。

1.7 肝 组 织 中TGF-β/T β R/Smad2/3 信 号 通 路mRNA水平测定 肝脏组织TGF-β1、TβRⅠ)、TβRⅡ、Smad2/3 mRNA 水平采用RT-PCR 测定。肝脏组织100 mg 匀浆处理后采用Trizol 试剂盒进行总RNA 抽提，抽提后采用DEPC 水溶解后在紫外分光光度计上进行总RNA 浓度测定。依据High-capacity cDNA reverse transcription kits进行mRNA反转录。在RT-PCR仪上进行RT-PCR 扩增，反应条件设置为：在95℃、95℃、60℃分别处理30 s、5 s、34 s，一共需要循环40次，引物序列见表1。内参选择GAPDH，最终结果采用2-ΔΔCt计算。

表1 各引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 肝组织中相关信号通路蛋白表达测定 肝脏组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 蛋白水平采用蛋白印迹法进行测定。小鼠肝脏组织剪碎后置于蛋白裂解液中获得总蛋白，采用BCA试剂盒确定提取蛋白浓度，置于沸水浴中加热10 min，电泳后进行转膜处理，蛋白应用5%脱脂牛奶置于室温下封闭处理1 h，加入一抗后置于4℃过夜处理，第2天应用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，随后添加对应二抗，室温环境孵育1 h，磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次添加发光液予以显色，GAPDH 为内参。凝胶成像系统拍照后采用Image J软件进行分析。

1.9 统计学方法 应用SPSS20.0 软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠肝脏组织病理学染色情况比较 HE染色可见正常组织内部肝细胞规律整齐排列，肝叶结构完整(图1A)；模型组可以肝组织结构异常，存在大量无序假小叶结构，小叶内部可以明显观察到纤维化和局灶性细胞坏死，其中存在大量炎症细胞浸润，可见异型细胞，细胞的细胞核呈不规则状(非典型性癌灶)，肝小叶结构出现不同情况损伤(图1B)；恩度组虽然依然可见肝细胞损伤及炎症细胞浸润，但是损伤较模型组轻，肝纤维化程度低，假小叶形成不明显(图1C)。

图1 HE染色(40×)Figure 1 HE staining(40×)

2.2 三组大鼠肝组织肝脏纤维化分级、肝脏指数及肿瘤情况比较 恩度组大鼠肝脏纤维化分级、肝脏指数、结节数、瘤重明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而恩度组与模型组大鼠肝脏指数均高于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 本组大鼠肝组织肝脏纤维化分级、肝脏指数及肿瘤情况比较(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

表2 本组大鼠肝组织肝脏纤维化分级、肝脏指数及肿瘤情况比较(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

组别正常组模型组恩度组t/F值P值只数抑瘤率(%)5 5 5肝脏纤维化分级-4.00±0.71 2.60±0.55b 3.486 0.008肝脏指数(%)1.56±0.29 5.19±0.72a 3.97±0.51ab 59.336 0.001结节数(个)-10.82±2.67 7.43±1.82b 2.346 0.047瘤重(g)-2.95±0.33 1.52±0.39b 6.259 0.001--18.26±3.86--

2.3 三组大鼠的肝功能比较 模型组大鼠的ALT、AST、TBI 水平明显高于正常组，ALB 水平明显低于正常组，而恩度组大鼠的ALT、AST、TBI 水平明显低于模型组，ALB 水平明显高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 三组大鼠的肝功能比较(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

表3 三组大鼠的肝功能比较(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

组别正常组模型组恩度组F值P值只数5 5 5 ALT(U/L)36.52±4.01 88.56±9.87a 64.85±7.12b 62.015 0.001 AST(U/L)58.63±6.25 176.21±18.60a 109.58±11.36b 101.447 0.001 TBI(μmmol/g)4.36±0.58 11.14±1.26a 7.59±1.39b 44.737 0.001 ALB(g/L)44.85±4.85 22.74±2.39a 38.52±4.06b 42.539 0.001

2.4 三组大鼠的肝组织纤维化情况比较 模型组大鼠羟脯氨酸、碱性磷酸酶水平明显高于正常组，恩度组大鼠羟脯氨酸、碱性磷酸酶水平明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 三组大鼠的肝组织纤维化情况比较(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

表4 三组大鼠的肝组织纤维化情况比较(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

组别正常组模型组恩度组F值P值碱性磷酸酶(kU/L)2.65±0.39 6.76±0.68a 5.32±0.61b 66.123 0.001只数5 5 5羟脯氨酸(μg/g)2.41±0.32 6.85±0.74a 4.26±0.51b 81.981 0.001

2.5 三组大鼠肝组织中TGF-β/TβR/Smad2/3信号通路mRNA 水平比较 模型组大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 等mRNA 水平明显高于正常组，而恩度组大鼠的TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3等mRNA水平均明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 三组大鼠肝组织中TGF-β/TβR/Smad2/3 信号通路mRNA水平比较(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

表5 三组大鼠肝组织中TGF-β/TβR/Smad2/3 信号通路mRNA水平比较(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

组别正常组模型组恩度组F值P值0.94±0.13 2.24±0.34a 1.76±0.18b 41.025 0.001 5 5 5 1.72±0.22 3.36±0.42a 2.32±0.31b 32.184 0.001 0.95±0.12 2.86±0.47a 1.74±0.19b 50.908 0.001 0.91±0.10 2.92±0.36a 1.71±0.20b 85.526 0.001 Smad2/3只数TGF-β(ng/mL)TβRⅠTβRⅡ

3 讨论

DEN 所致肝癌模型与人体肝癌发生进展过程相似，为探究肝癌发生进展机制及筛选肝癌治疗潜在药物[7]，本研究选择DEN 诱导肝癌大鼠模型作为研究对象。在应用DEN处理后，模型组大鼠可见肝脏组织表面逐渐粗糙，可见结节存在，结节数量随着饲养时间延长而变多，结节大小不一，显示大鼠肝组织出现癌变变化。HE 染色可见，模型组大鼠肝脏组织结构中存在大量无序假小叶结构，其内浸润有大量炎症细胞，伴有大量异型癌灶细胞，这些细胞细胞核形状不规则，显示DEN诱导肝癌模型成功。

恩度作为血管内皮抑制剂，已被应用于多种肿瘤治疗中，目前研究证实其可以经由阻断血管内皮生长因子受体磷酸化过程，将新生血管形成信号传导过程阻断，进而发挥明显抗肿瘤作用[8-9]。本研究中恩度组大鼠肝脏纤维化分级、肝脏指数、结节数、瘤重均低于模型组，恩度组大鼠抑瘤率为(18.26±3.86)%，显示重组人血管内皮抑制素恩度确实可以发挥抑制肿瘤生长作用。吴占庆等[10]研究显示中晚期原发性肝癌采用重组人血管内皮抑制素治疗可以经由抑制新生血管形成，阻断病灶营养，发挥显著抗肿瘤作用。研究显示肝细胞癌进展过程包括慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化等诸多过程，其中羟脯氨酸作为形成胶原重要氨基酸，碱性磷酸酶在肝细胞损伤或者癌变情况下释放异常增多[11]。本研究中肝癌大鼠应用恩度处理后，羟脯氨酸、碱性磷酸酶等纤维化指标水平下降，显示恩度有效抑制肝癌大鼠肝纤维化进程，既往研究中恩度经由抑制新生血管生成发挥抗肿瘤作用[12]，本研究中恩度可能通过减轻肝癌大鼠肝脏损伤及纤维化程度发挥显著抗肿瘤作用。

为明确恩度对肝癌大鼠抗纤维化-抗肿瘤具体作用机制，本研究测定了大鼠TGF-β/TβR/Smad2/3 信号通路mRNA 及相关蛋白水平。本研究中模型组大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ等mRNA水平均显著高于正常组，分析认为TGF-β可以促进肝星状细胞活化，促进胶原蛋白分泌，抑制胶原蛋白水解酶活性，使细胞外基质降解及合成平衡被打破，并在组织间隙沉积，导致肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，进而使肝脏出现纤维化病变[13]。恩度处理则会抑制肝组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ基因水平，TβRⅠ、TβRⅡ为TGF-β受体，为激活下游Smad 信号重要条件[14]，推测恩度抗纤维化-抗肿瘤作用可能与抑制TGF-β及其受体表达有关。TGF-β/Smad 信号通路发挥作用过程主要为：TGF-β与TβRⅡ结合，随后募集并活化TβRⅠ，TβRⅠ使Smad2/3激活，形成磷酸化Smad2/3，其后与Smad4构成异源三聚体复合物，复合物入核后可以发挥调节目的基因表达情况，胞浆内部Samd7 入核后则会促进复合物解离而中止上述反应[15-17]，因此，推断恩度下调肝组织TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ表达，进而抑制下游Smad2/3信号通路信号传导。另有研究显示α-亚麻酸植物甾醇酯有助于改善小鼠肝纤维化，这一作用与α-亚麻酸植物甾醇酯下调TGF-β1表达并抑制下游靶分子Smad蛋白表达关系密切[18]，与本研究中相关结论类似。Yang等[19]研究也显示在肝脏疾病的发生过程中，TGF-β信号转导介质Smads受到结构域特异性位点磷酸化的严格控制，Smad3 磷酸亚型pSmad3L 和pSmad3C 是可逆的和拮抗的；pSmad2L/C 可通过刺激细胞外基质合成，与pSmad3L 共同作用，介导肝组织纤维化过程，与本研究中相关结论一致。

综上所述，恩度可以明显抑制DEN诱导大鼠肝纤维化-肝癌过程，其作用机制可能与抑制TGF-β及相应受体表达、调控下游Samd2/3 信号激活有关。本研究虽然证实恩度可以发挥明显抗纤维化-肝癌作用，但是并未明确采用何种浓度恩度处理才可发挥最佳抗纤维化-肝癌效果，这将是下一步研究关注重点。